167248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentációs úton stabil, kristályos nasztatin előállítására és izolálására a fermentációs táptalaj enzimes kezelése mellett

167248 7 8 riumklorid 0,2%, káliumdihidrogénfoszfát 0,1%, pálmaolaj 0,4%, pH: 6,2. A táptalaj térfogata 100 ml, 500 ml-es Erlenmeyer lombikban. Beoltás után 28 °C-on, 220/perc rázatási sebességgel rázóasztalon tenyésztjük 24 órán át, majd a kifejlődött oltóanyagot 5 térf.%-ban átoltjuk a következő összetételű steril fermentációs táptalajba (70 ml táptalaj, 500 ml-es Erlenmeyer lombik): kukoricaliszt' 7,0%, kukoricalekvár (sz. a.) 0,35%, kalciumkarbonát 0,5%, ammóniumnitrát 0,45%, nátriumklorid 0,2%, trinátriumfoszfát 0,04, pálmaolaj 0,2%, pH: 6,5. A steril táptalaj látszólagos viszkozitása: 3,15 P. 4 napos, 28 °C-on, rázóasztalon történő tenyésztés után meghatározzuk a nisztatin tartalmat: 8500 E/ml. A meghatározás a következő módon történik: Egy visszafolyató hűtővel, hőmérővel, 3 csiszolatos dugóval ellátott 3 nyakú 500 ml-es gömblombikba mérőhengerrel bemérünk 20 ml 96%-os ecetsavat, 10 ml 15%-os kénsavat, néhány üveggyöngyöt és forrásig melegítjük (105—110 °C). Forrásponton a csiszolatos dugó eltávolításával gyorsan hozzáadjuk a bemérőcsónakon 0,1 mg pontossággal bemért 0,1 g nisztatint, melyet 10 ml 96%-os ecetsavval kvantitatíve a gömblombikba mosunk, majd azonnal hozzáadunk 25,00 ml 0,1 n jódmonoklorid mérőoldatot. A lombikot gyorsan lezárjuk, néhány másodpercet várunk, míg az oldat hőmérséklete ismét forráspontra emelkedik, ezután 2 percig forraljuk, az időt stopperral ellenőrizzük. A két perc letelte után a melegítést megszüntetjük, és a visszafolyató hűtőn keresztül 10 ml 10%-os Ky oldatot csurgatunk a lombikba. A hűtőről, hőmérőről az esetleg lekondenzált mérőoldatot desztillált vízzel kvantitatíve a lombikba mossuk és a fölös jódot 0,1 n nátriumtioszulfáttal keményítő indikátor mellett megtitráljuk. 25,00 ml 0,1 n jódmonokloriddal teljesen azonos módon vakpróbát készítünk. 1 ml 0,1 n jódmonoklorid 11,58 mg nisztatint mér. Az egyenértéksúlyt a Tetrahedron Letters 8, (1971), 685—690 [,,A nisztatin polien antibiotikum teljes szerkezete" című] cikkben megjelent képlet alapján számolt mólsúllyal adtuk meg. 2. Az 1. példa szerinti technológiát ismételjük azzal az eltéréssel, hogy a fermentációs táptalajt sterilezés előtt enzimatikusan hidrolizáljuk. A hidrolízishez 0,003% amiláz — neutrális proteáz enzim komplexumot használunk. Az enzim aktivitása 5000 SKB E/g amilázra vonatkozóan, és 1,2 Anson E/g proteázra vonatkozóan, A hidrolízist 60 °C-on pH: 6,5-on 15 percig végezzük. Ezután a táptalajt felforraljuk, majd a lombikokba szótosztva sterilizáljuk. A steril táptalaj látszólagos viszkozitása 0,32 P. A fermentáció végén 4 napos tenyésztés után meghatározzuk az 1. példában leírt módon a nisztatin tartalmat: 30800 E/ml. 3. Az 1. példa szerint előállított 100 ml oltóanyagot beoltjuk 5000 l-es előfermentorba, mely 3000 i steril inokulum táptalajt tartalmaz, melynek összetétele azonos az 1 példában leírt táptalajéval. Beoltás után 28 °C-on, 24 órán át tenyésztjük 180 m3

/ó átmenő levegő mennyiséggel (kevertetés 160 fordulat/perc). A kifejlődött oltóanyagot beoltjuk 30 000 1 steril fermentációs táptalajba, melyet az 1. példa szerint készítettünk. A steril táptalaj látszólagos viszkozitása 0,96 P. A fermentációt csőfermentorban végezzük 4 napon át, 28 °C-5 on, 1800 m3/ó átmenő levegő mennyiséggel. A fermentáció végén meghatározzuk az 1. példában leírt módon a nisztatin tartalmat: 18 200 E/ml. 4. A 3. példa szerint járunk el, de a fermentációs 10 táptalajt a 2. példa szerint hidrolizáljuk enzimatikusan, sterilizálás előtt. Sterilizálás után a táptalaj látszólagos viszkozitása: 0,17 P. A 4 napos fermentáció után az 1. példában leírt módon határozzuk meg a nisztatin tartalmat: 31 300 E/ml. 15 5. A 4. példa szerint előállított 30 000 liter fermentléhez —• melynek biológiai aktivitása 31,300 E/ml — 60 kg foszforsavat adagolunk és a pH értéket nátronlúggal pH = 7,0—7,2-re állítjuk. A kezelt fermentlevet szűrőprésen szűrjük, majd 20 a nedves csapadékot vékony rétegben alumíniumtálcákra helyezzük és 60—65 °C hőmérsékleten szárítjuk, max. 3% nedvességtartalomig, végül 400 nift szemcseméretre őröljük. Összesen 780 kg „nisztatin micélium bázist" 25 kapunk, melynek biológiai aktivitása 820 E/mg, azaz összesen 639,6 milliárd egység. A 780 kg nisztatin micélium bázist 1560 liter acetonban szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót zárt rendszerű zománcozott, visszacsepegő hűtővel 30 ellátott készülékben, az oldószer forrpontjan 30 percig visszafolyatjuk. Ezután a szuszpenzió hőmérsékletét 20 °C-ra csökkentjük, a szilárd részeket szűrőprésen kiszűrjük, a kapott csapadékot megszárítjuk. 35 A csapadók kristályos nisztatint, micéliumot, tápanyagmaradékokat, egyéb nem definiált, acetonban oldhatatlan részeket tartalmaz. Amennyiben ehhez a hatóanyagot tartalmazó szárított micéliumhoz antioxidánst (pl. etoxi-metil-kinolin) 40 adagolunk, úgy olyan stabil nisztatin tartalmú termékhez jutunk, amely „feed-grade" minőségű, és amelynek a mezőgazdaságban több célú felhasználása lehetséges. Az acetonos tisztítás után a nisztatin micélium 45 bázist — melynek súlya 650 kg—2000 liter —10 °C hőmérsékletű, 50 kg kalciumkloridot tartalmazó metanollal extraháljuk. Az alkalmazott extrakciós idő 30 perc. Az extrakció befejezése után a csapadékot szűrőprésen kiszűrjük, majd újra extraháljuk 50 az előbbiekben leírt módon, azzal a különbséggel, hogy a kalciumklorid mennyisége 25 kg. Az egyesített szűrletek térfogata 3000 liter, hatóanyaga 180 000 E/ml. Az egyesített extraktleveket 32 kg Norit—C mi-55 nőségű derítőszénnel kezeljük és élesre szűrjük. A derített extraktléből a hatóanyagot 45 °C hőmérsékletű pH-7,0 értékű csapvízzel kicsapjuk. Az alkalmazott víz mennyisége az extraktló térfogatának 1,2-szerese. 60 A képződött szuszpenzió pH-ját vegytiszta ammóniumhidroxid oldattal 6,4-re állítjuk, 4 órán át állni hagyjuk, s a hőmérsékletet 20 °C-ra csökkentjük. A képződött csapadékot, mely 50—50%-ban tartalmaz kristályos és amorf terméket, zárt rend-65 szerű, programvezérlésű „Funda" rendszerű szűrő-4