167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
65 167238 66 hozzá ós 15 percig —15°-on állni hagyjuk. —20°-ra hűtjük és 4,8 ml trietilamint, majd 9,0 g, 34. pontban előállított vegyület 210 ml 90%-os dimetilformamidos oldatát adjuk hozzá. Erős hűtéssel a belső hőmérsékletet —15°-on tartjuk. Egy óra alatt 0°-ra melegítjük, mialatt megfelelő mennyiségű trietilamin hozzáadásával a pH-órtéket 7—8 között tartjuk. Ezenkívül még 3,5 ml trietilamint adunk hozzá. Egy éjszakán át 0°-on keverjük, majd 3 liter éterbe öntjük, a pelyhes csapadékot leszűrjük és kétszer éterrel és egyszer vízzel mossuk. A nyers terméket 500 ml meleg metanolban oldjuk és 1,5 liter 1%-os ecetsavoldatba öntve kicsapjuk. A leszűrt és vízzel kétszer mosott terméket mégegyszer ugyanígy kicsapjuk. Rf100 = 0,33 (szilikagéles lemezen). 36. H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH-acetát 1,7 g, fenti védett dodekapeptidet 100 ml 80%-os ecetsavoldatban oldunk és 0,5 g 10%-os palládium-szén-katalizátor jelenlétében a szokásos módon hidrogénezzük. A katalizátort leszűrjük és az oldatot nagy vákuumban erősen bepároljuk, majd a maradékot terc-butanollal liofilizáljuk. A kvantitatív termeléssel keletkezett, vékonyrétegkromatogramon (Rf100 =0,1 szilikagélen) egységes terméket azonnal továbbalakítjuk. 37. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH 1,73 g, 22. pontban leírt peptidszármazékot 50°-on 10 ml dimetilformamidban oldunk. —20°-ra hűtés után 0,9 ml 4,2 n dioxános sósavoldatot csepegtetünk hozzá. Ezután —15°-on 0,22 ml terc-butilnitritet adunk hozzá és 15 percig —15°-on reagáltatjuk. Majd ismét —20°-ra hűtjük és 0,53 ml trietilamint és 1,6 g 36. pontban leírt peptidszármazék 40 ml 90%-os dimetilformamidos oldatát csepegtetjük hozzá. A hőmérsékletet 1 óra alatt 0°-ra emeljük, miközben trietilamin részletek hozzáadásával a pH-t 7 és 8 között tartjuk, összesen 0,25 ml trietilamint adagolunk. További 15 órás 0°-on történő keverés után a terméket éterbe öntéssel kicsapjuk és a csapadókot szűrjük, majd éterrel és vízzel mossuk. Tisztítás céljából egyszer dimetilformamid-etilacetát és egyszer dimetilformamid-0,02 n sósav elegyből kicsapjuk. A tiszta anyag szilikagéles vékonyrótegkromatogramon Rf100 = 0,40 értéket ad. 38. Z-Ala-Pro-NH2 2,28 g H-Pro-NH2 és 7,57 g Z-Ala-ONP vegyületeket 20 ml dimetilformamidban oldunk és a sárga oldatot 18 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután nagy vákuumban szárazra pároljuk, a maradékhoz étert adunk, és a keletkezett port alaposan eldörzsöljük. Leszívatás és szárítás után 5,5 g Z-Ala-Pro-NH2 keletkezik, op.: 167,5—168,5°. [a]o — —74° (c = 1,0, metanolban). 39. Z-Gly-Ala-Pro-NH2 27,1 g fenti dipeptidszármazékot 425 ml etanolban oldunk és 85 ml 1,0 n vizes sósavoldatot hozzáadva 4,25 g 10%-os palládium-szén-katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A hidrogénezés végén az oldatot 40—50° fürdőhőmérséklet mellett vákuumban bepároljuk. A maradékot 40°-on 40 ml 5 dimetílformamiddal oldjuk és az oldatot 20°-ra hűtjük. Ezután 29,1 g Z-Gly-ONP vegyületet adunk hozzá és az oldódás után 45 perc alatt 11,2 ml abszolút trietilamint csepegtetünk hozzá, keverés közben. A szuszpenziót 40°-on ós 0,01 torr nyomáson 10 bepároljuk és a maradékot 600 ml víz és 300 ml éter között megoszlatjuk. A vizes fázist kétszer 300 ml éterrel és az éteres fázist kétszer 300 ml vízzel extraháljuk. A vizes frakciókat egyesítve vákuumban 40—50°-on bepároljuk és többször kloroform hozzá-15 adásával és bepárolva víztelenítjük. A jól szárított maradékot 40—50°-on 500 ml etilacetátban felvesszük, az oldhatatlan trietilamin-hidrokloridot leszűrjük és a szűrletet 30—40°-on 10 ml éterrel keverjük össze, amikor kristályosítás lép fel. Kb. 20 20 órás + 5—f- 10°-os állás után a kristályokat elválasztjuk, mossuk és szárítjuk. Op.: 105—106°. A termék 3% trietilamin-hidrokloridot tartalmaz. Ezt ilyen formában felhasználhatjuk a továbbiak során. Tisztítás céljából 5,0 g fenti nyers kritályos termé-24 ket 10 ml vízben oldunk, és 20 ml metilónkloridot, majd 15 ml telített káliumkarbonátoldatot adunk hozzá. A szerves fázist elválasztjuk, 10 ml telített káliumkarbonátoldattal, a vizes fázist pedig 15 ml metilénkloriddal extraháljuk. Az egyesített metilón-30 kloridos fázisokat vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk és bepároljuk. A maradékot 50 ml etilacetátból kikristályosítjuk. így 4,4 g tripeptidszármazékot kapunk. Op.: 109—112°. Aceton-metanol-éter (10: :4:6) elegyből átkristályosítva 144,5—145,5° olva-35 dáspontú kristályokat nyerünk (kristálypolimorfia). [a]a = —93° (c = 1,0, metanolban). Szilikagéles vókonyrétegkromatográfiás vizsgálat során kloroform-metanol (8:2) rendszerben Rf = 40 = 0,38. 40. H-Gly-Ala-Pro-NH2 18,8 g, 39. pontban előállított nyers tripeptid származékot 400 ml dimetilformamidban oldunk és 45 1,0 g 10%-os palládium-szén-katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A hidrogénezés befejeztével szűrjük és az oldatot rövid gáztalanítás után a következő lépésre használjuk fel. 50 4L Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 A 40. pontban kapott tripeptid oldatához (550 ml) 20,1 g Z-Val-ONP vegyületet adunk és az elegyet 18 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután 50—60°-on és 0,01 torr nyomáson szárazra 55 pároljuk, a maradókot 300 ml éterrel eldörzsöljük és szűrjük. A szüredéket szárítjuk és 210 ml abszolút etanolban 15 percig 70—80°-on keverjük, 0°-ra hűtjük és szűrjük. A maradékot 170 ml abszolút tetrahidrofurán, 25 ml víz és 110 ml éter elegyéből 60 kikristályosítjuk. Op.: 209—211°. Rf -érték szilikagéles lemezeken: 0,42, kloroform-metanol (8:2) rendszerben. 42. H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 35 1,1 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH 2 vegyületet 50 ml 33
