167128. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új komplex antibiotikum, a violamicin és összetevői előállítására
9 167128 10 A 115 C-on 35 percen át sterilizált, 6,3 pH-jú közeget beoltás után 28 C°-on 180 fordulat/perc frekvenciájú rázóasztalon inkubáljuk. A maximális violamicin-tartalmat (125mcg/ml) 72 órás fermentáció után érjük el. Az aktivitást 5 több ismert és új mikrobiológiai agardiffúziós eljárással vizsgáljuk. A módszer lényege, hogy az antibiotikum bakteriális vírusok szaporodására gyakorolt gátló hatását értékeljük [Fleck W.: Alig. Mikrobiol. 8 (2), 139 (1968)]. 10 4. példa butanolos extraktumokat a tenyészoldat eredeti térfogatának 1/25 részére betöményítjük. Abetöményített extraktumhoz háromszoros térfogatú petrolétert adunk, mire a biológiailag aktív nyerstermék kiválik. 1 m3 tenyészoldatból 300 g nyersterméket kapunk. A nyersterméket az alábbiakban a termelő' törzs után a 6844 terméknek nevezzük. 2. példa Az 1. példában leírt módon járunk el azzal az eltéréssel, hogy az alábbi összetételű tápoldatot alkalmazzuk: glükóz 1% keményítő 1% szójaliszt 1% élesztő 0,5% (Bacto Yeast Extract, gyártja: Difco) nátriumklorid 0,5% kalciumkarbonát 0,3% csapvízben. A közeget 116C°-on 40 percen át sterilizáljuk, a pH érték utána 6,2. A maximális violamicin-tartalmat (100 meg/ml) 90 óra után érjük el. 3. példa Az 1. példa szerinti szilárd táptalajon tenyésztett Streptomyces violaceus IMET JA 6844 kultúrával 80 ml-t az 1. példa szerinti folyékony előtenyésztő közegből oltunk be, amely 500 ml űrtartalmú lombikban van. 24 órán át 28 C°-on inkubálunk 180 fordulat/perc frekvenciájú rázógepen. Az így kapott tenyészetszuszpenzióból 12 ml-t átviszünk 2 literes üveglombikba, amely 400 ml azonos összetételű előtenyésztő közeget tartalmaz. A kultúrát 28C°-on 180 fordulat/perc frekvencia mellett 24 órán át inkubáljuk, majd az így kapott 400 ml tenyészetszuszpenzióval az 1. példában leírt tenyésztőközeg 20 literét oltjuk be, amely 32 liter űrtartalmú üvegfermentorban van. 400 fordulat/perc keverési sebesség mellett percenkent 15 liter levegőt hozzávezetve inkubáljuk, a habképződést kismennyiségű napraforgóolaj vagy szilikontartalmú habzásgátló hozzáadásával kiküszöböljük. A 20 liter kultúraoldat pH értékét sósavval 5,0-re állítjuk be, és a micéliumot elválasztjuk. A kapott 18 liter szűrletet butanollal extraháljuk és a butanolos extraktumot vákuumban térfogatának 1/10 részére betöményítjük. A micéliumot 1 : 6 arányban alkalmazott metanollal kétszer extraháljuk, az egyesített metanolos extraktumokat csökkentett nyomáson térfogatának 1/20 részére betöményítjük, és az így kapott vizes fázist butanollal kimerítően extraháljuk. Aszűrletből nyert butanolos extraktumot a micéliumból nyert , butanolos extraktummal egyesítjük, és az egyesített Az IMET JA 6844 törzs előtenyésztését a 3. példában leírt módon végezzük, a 32 literes fermentorból azonban a tenyészetet átvisszük egy 15 400 Uteres V2A tankba, amely 360 litert az 1. példában leírt tenyésztőközegből tartalmaz. A keverési sebesség 280 fordulat/perc, levegőbevezetés 440 liter/perc. 20 A tenyészetszuszpenziót a 3. példában megadott módon feldolgozva 300 liter tenyészfolyadékból 300 g A 6844 nyersterméket kapunk. A nyerstermékből a biológiailag aktív komplexeket, azaz A violamicint és B violamicint állítunk elő. 25 5. példa 200 g A 6844 nyersterméket 5 liter kloroform-30 ban szuszpendálunk, a szuszpenziót 1 órán át keverjük, majd az oldhatatlan maradékot eltávolítjuk az oldatból. A kloroformos oldatot fele térfogatú vízzel 5-6-szor mossuk. Ezáltal az oldatot teljesen megtisztítjuk a vízben oldódó pigmentek-35 tói, egyben a B violamicin átmegy a vizes fázisba. A kloroformos oldatot szárítjuk, a kiindulási térfogat 1/50 részére bepároljuk, majd tízszeres mennyiségű petroléterrel keverjük. A biológiailag aktív A violamicinfrakció kicsapódik. A csapadékot 40 leszűrjük, tiszta petroléterrel mossuk, majd csökkentett nyomáson' exszikkátorban tömény kénsav felett szárítjuk. 16 g A violamicint kapunk. Az A violamicinfrakciót oszlopkromatográfiai 45 módszerrel két részre, mégpedig az A violamicin antibiotikumra és a biológiailag inaktív A violamicinra választjuk szét. 10g A-frakcióból 5g A violamicint nyerünk. 50 AB violamicinfrakciót a kloroformos oldat mosóvizéből nyerjük ki. A mosóvizet pH 8,5-re állítjuk be, majd butanollal extraháljuk. A butanolos extraktumot betöményítjük, petroléterrel keverjük, és a keletkező csapadékot leszűrjük, szárít-55 juk. 200 g A 6844 nyerstermékből 25 g B violamicinfrakciót kapunk. A B frakció, csakúgy mint az A frakció, B violamicin antibiotikumra és biológiailag inaktív B 60 violamicinonra bontható. 10 g B frakcióból 9,5 g B violamicin antibiotikumot kapunk. A B violamicin antibiotikumot gélszűréssel két komponensre, a Bt violamicinre és a Bn violamicinre bonthatjuk. Azt találtuk, hogy a B violamicin 90%-a Bt violamicin, 65 10%-a Bn violamicin. 5
