167121. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú gentamicin c komplex és/vagy gentamicin c komponensek előállítására
3 167121 4 A 3 091 572 sz. USA-beli szabadalmi leírás szerint a leszűrt erjesztéses oldatból karboxil-típusú kationcserélő gyantán történő megkötés után híg kénsawal (pH = 0,5-2,0 értékben) oldják le a gentamicin C-t, az eluátumot kis térfogatra bepá- 5 rolják, a sókat 10-es pH értéken nagytérfogatú acetonnal lecsapják, majd a szűrletet 5-ös pH értéken újra bepárolják, és metanol hozzáadásával igen szennyezett, körülbelül 30% tisztaságú nyers gentamicin C szulfátot kapnak. Ezt a nyers ter- 10 méket vízben oldják, majd erősen bázisos kationcserélő gyantán átfolyatva a szervetlen anyagok maradékát eltávolítják,' az efluenst szárazra párolják, a párlási maradékot metanolban oldják, és 20-szoros térfogatú acetonnal lecsapják a vissza- 15 maradó szennyezéseket. A szűrletet újra szárazra párolják, a párlási maradékot metanolban oldva a kísérő anyagcsereterméket éterrel csapják le, végül az így kapott szűrletet szárazra párolva mintegy 30%-os hozammal körülbelül 85% tisztaságú genta- 20 micinC-t kapnak. A fenti szabadalmi leiratban ismertetett másik módszer szerint a nyers gentamicin C szulfát elkülönítését és tisztítását többszöri nátriumdodecilbenzolszulfonátos lecsapással, majd a komplex só metanolos oldatának Amberlite 25 IRA-401S gyantán történő megbontásával állítják elő. Hasonló módszert ismertet a 2145 395 sz. NSZK-beli közzétételi irat, azzal az eltéréssel, hogy 30 a nátrium-dodecil-benzolszulfonátos komplex-képzést követően a komplex-só metanolos oldatát Wofatit SBW-gyantán bontják el. Mindezen módszerek igen körülményesek, többszöri nagytérfogatú szerves oldószeres (éter, aceton, metanol) lecsa- 35 pásokat és bepárlásokat, valamint ioncserélő gyantás sómentesítési lépéseket igényelnek. A szabadalmi példák tanúsága szerint a kapott gentamicin C hozam elég gyenge, 30-40%-os, minősége pedig nem felel meg az Amerikai Gyógyszerkönyv 40 (United States Pharmacopeia^-XVIII, a továbbiakban: USP-XVIII) követelményeinek. Aszulfátsó optikai forgatóképessége pl. 1%-os vizes oldatban ugyanis +102°, szemben az USP-ben szereplő +107—(-121°-os követelménnyel. 45 "vizsgálataink során azt találtuk, hogy vizes oldatokból, pl. leszűrt erjesztéses oldatokból igen nagy tisztaságú gentamicin C és/vagy egyes tiszta gentamicin C komponensek rendkívül egyszerűen és 50 kiváló hozammal állíthatók elő kétlépcsős ioncserélős technika alkalmazásával olyan módon, hogy első lépésben a semleges gentamicin C tartalmú oldatot teljes telítésig átfolyatjuk egy ammónium-formában levő karboxil-típusú kationcserélő gyan- 55 tán, majd erről a gentamicin C-t és a kísérő anyagcseretermékek elegyét együttesen leoldjuk nagy töménységű erős ásványi savval, majd az eluátumot gyengén bázisos pH értéken megkötjük egy speciális finomszemcsés karboxil-típusú kation- 60 cserélő gyantán, ezután a szennyezéseket és a gentamicin C-t az oszlopról fokozatosan növekvő töménységű vizes ammóniumbázis oldatokkal szelektive leoldjuk, és a gentamicin C tartalmú frakciókat szárazra pároljuk. Azt találtuk továbbá, hogy 6S a gentamicin Ci előállítása céljából ioncserélő dextrángél-oszlopon célszerű az előzőekhez hasonló gradiens eluciós kromatográfiai végezni. A fentiekben megfelelően a találmány eljárás nagytisztaságú gentamicin C komplex és/vagy gentamicin Ci, gentamicin Cia és gentamicin C 2 , valamint ezek sóinak előállítására vizes oldatokból, célszerűen Micromonospora fajok által termelt erjesztéses oldatokból gentamicin C komplexnek nátrium vagy ammórdumformájú, poliakrilsav- vagy polimetakrilsav-vázas karboxil-típusú kationcserélő gyantán végzett megkötése útján oly módon, hogy a gyantán megkötött gentamicin C komplexet erős ásványi sav 2,5-5,5 n vizes oldatával, célszerűen 3,5-4,5 n kénsawal leoldjuk és a kapott eluátumot vagy bármely szennyezett gentamicin C tartalmú vizes oldatot 5-11 pH értéken célszerűen 7,0-9,0 pH értéken a) ammónium-formában levő karboxil-típusú kationcserélő gyantán megkötjük, majd a gentamicin C komplex komponenseit, illékony ammóniumbázisok 0,05 n és 1,0 n között fokozatosan növekvő koncentrációjú, előnyösen 0,05—0,30 m koncentrációjú vizes oldatainak segítségével egymást követően (gentamicin C2 , gentamicin Ci, gentamicin Cj a sorrendben) leoldjuk és külön frakciókban szedett tiszta gentamicin C komplexet vagy gentamicin C2 -t, illetve gentamicin Cla -t tartalmazó frakciókból az ammóniumbázist és vizet eltávolítjuk, és az így kapott szabad bázisokat adott esetben sóvá alakítjuk, vagy b) adott esetben a gentamicin Ct előállításakor az elválasztást karboxil-típusú kationcserélő gyanta helyett ammóniumformában levő karboximetü-csoportokat tartalmazó dextrángél oszlopon végezzük és a gentamicin Cia , gentamicin C 2 , gentamicin Ct sorrendben leoldódó anyagok közül a gentamicin Cj-tartalmú frakciókat egyesítjük és az ammónium-bázist és a vizet eltávolítjuk, majd az így kapott gentamicin Q bázist adott esetben sóvá alakítjuk. A gentamicin C leoldására ammóniumbázisként Rix célszerűen ^N-R3 általános képletű vegyület R2 vizes oldatát használhatjuk, ahol Rí, R2 és R 3 jelentése hidrogénatom vagy CH3 -, C 2 H S - vagy C3 H 7 -csoport. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a vizes oldatot, mely lehet leszűrt erjesztéses oldat, vagy bármely más, gentamicin C-t tartalmazó oldat, egy nátrium-formában levő karboxil-típusú kationcserélő gyantát tartalmazó oszloprendszeren folytatjuk át pH = 4,0-10,0, előnyösen pH = 7,0-8,0 értéken olyan módon, hogy az egyes gyantaágyak teljes mértékben telítődjenek gentamicin C-val, vagyis a megkötés befejezésekor az oszlopon átfolyt oldat gentamicin C tartalma megegyezzék az oszlopra felvitt oldat gentamicin C tartalmával. Ezután a gentamicin C-t az oszlopról kénsav vagy sósav 3,5-4,5 n vizes oldatával leoldjuk. A kapott eluátumot igen nagy koncentrációban 2
