166989. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinsó-protamin komplex vizes szuszpenziójának előállítására

7 166989 8 A fenti adatokból kiderül, hogy a protamin-inzulin-komplex hatása gyorsan jelentkezik és ez a hatás hosszú ideig fennmarad. A következő kísérletben háromféle semleges protamin-nátriuminzulin-készítmény hatását vizs- 5 gáltuk oly módon, hogy 100 egység inzulinra vonatkoztatva 0,02 mg cinket adagoltunk. Mindegyik inzulin-készítmény 0,02 mg cinket tartalmaz/100 egység inzulin. A kísérletet azon célból végezzük, hogy meghatározzuk, vajon befolyásolja-e 10 vagy nem a cink jelenléte a protamin-nátriuminzulin-komplex hatásának gyors jelentkezését és e hatás hosszú idejű érvényesülését. Az alábbiakban látni fogjuk, hogy a találmány szerinti eljárás szempontjából jó eredményeket kaptunk. Három készítményt hasonlítunk össze, ezek a sertésinzulin, marhainzulin és 75% marhainzulint és 25% sertésinzulint tartalmazó elegy. Mindegyik kísérletet 6 nyúllal végeztük oly módon, hogy a nyulakat közelítőleg 1 egység inzulinmennyiséget jelentő 0,01 ml térfogatú szuszpenzióval oltottuk. Az eredményeket a 3. ábrán és az alábbi 3. táblázatban tüntetjük fel. 3. táblázat Vércukor-tartalom, mg% Idő, óra 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Sertés Kevert Marha 80,3 80,2 85,5 41,5 40,5 42,6 A sertésinzulin hatása gyorsan jelentkezik, ugyanakkor hatása nem tart olyan hosszú ideig, mint a többi inzulinkészítményé. Ugyanakkor a marha- és a kétféle inzulinból álló készítmények hatása gyorsan jelentkezik és ez a hatás sokáig megmarad. Az előzőekben megjegyeztük, hogy a protamin-nátriuminzulin-komplexhez kismennyiségű cinket adtunk. Az előzőekben úgy találtuk, hogy kétértékű fém, például cink jelenléte nem szükséges az inzulin nátriumsójának előállításakor. A cink hozzáadásával a protamin-nátriuminzulin-komplexhez azt a kérdést kívánjuk eldönteni, hogy a cinknek van-e vagy nincs valamiféle hatása az inzulin-komplexre. A kísérlet eredményeiből kiderül, hogy a cink nem csökkenti és nem növeli a készítmény terápiás hatását. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük. 1. példa A példában az adagolásra alkalmas protamin-inzulin-komplex előállítását szemléltetjük A kristályos marhainzulin nátriumsóját a következő eljárás szerint állítjuk elő: Az inzulint savas pH-jú víz-alkohol eleggyel extraháljuk marha-hasnyálmirigyből, az extraktumot csökkentett nyomáson töményítjük és nátriumkloridos frakcionált kicsapással vagy az izoelektromos ponton történő kicsapással részlegesen tisztítjuk. Az inzulint ezután pH 8,2-es értéken, lúgos kristályosítással tovább tisztítjuk. A kristályokat ecetsavban (0,5 N) oldjuk, majd Sephadex G-50-en (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország) kromatográfiás úton tisztítjuk. Az inzulint tartalmazó 0,5 n ecetsavas eluátum pH-ját 1,0 n nátriumhidroxiddal 8,2-re állítjuk be, 44,5 37,6 35,3 55,4 53,1 38,5 73,0 60,7 53,4 76,7 65,6 63,0 majd 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált nátriuminzulin kristályokat szűréssel elkülönítjük az anyalúgtól és a szűrési maradékot 2%-os vizes nátriumklorid oldattal mossuk. A mosott 30 kristályos terméket erőteljes keverés közben abszolút alkoholhoz adjuk, majd szűréssel ismét elkülönítjük azt. Végül abszolút alkohollal és éterrel ismét mossuk, majd csökkentett nyomáson szárítjuk a kristályos terméket. 35 Az így előállított kristályos marhainzulin nátriumsójának jellemző adatai a következők: Aktivitás 25,08 egység/mg 40 Nitrogéntartalom 15,82% Nedvességtartalom 8,0% Színindex 0,005 (340 nyi, 1%-os oldat) A száraz nátriuminzulin 3,98 g-ját 990 ml, 45 2,27 g folyékony halmazállapotú fenolt és 1,5 ml 10%-os sósavat tartalmazó pirogén-mentes vízben oldjuk. Az oldat pH-ját 1,7 ml 10%-os nátriumhidroxiddal 7,4-re állítjuk be. A standard U. S. P. módszerrel kivitelezett aktivitásmérés szerint az 50 oldat inzulinaktivitása 101,3 egység/ml. Az oldatot steril szűrés után ampullákba töltjük (1,0 ml/ampulla), majd az ampullákat steril körülmények között liofilizáljuk, amikor mindegyik fiolában száraz nátriuminzulinhoz jutunk. Az inzulint a 55 vizsgálatok idejéig ilyen alakban tároljuk. Mindegyik ampullába megfelelő mennyiségű izotóniás oldószert juttatunk, amikor az inzulin 101,3 egység inzulin/ml-es vizes oldatként áll rendelkezésünkre. Azizotóniás oldószer milliliteren-60 ként 0,4 mg protaminszulfátot, 1,6% glicerint és 0,25% fenolt tartalmaz (súlyszázalék). Az izotóniás oldószer pH-ja 7,4. Amikor az izotóniás folyadékot az ampullákban levő megszárított nátriuminzulinhoz adjuk, azonnal protamin-nátriuminzulin-komp-65 lex keletkezik. A komplex, mint igen finom 4