166890. lajstromszámú szabadalom • Eljárás FC-126 pulykaherpesvírus és Marek-betegséget okozó JM GA vírus stabil szuszpenziójának és liofilizátumának előállítására

166890 13 14 ml-es oldatrészleteket centrifugacsövekbe helyezünk, és ismét centrifugáljuk. A tömörített sejtek térfogata kb. 0,5 ml/cső. A felső folyadékréteget elöntjük, és a megfertőzött sejteket 2,0 ml foszfátpufferben — amely különböző mennyiségű albumint tartalmaz — újra szuszpendáljuk. 1:5 térfogatarányú hígítást kapunk. A szuszpenziókat a megfelelő hígítószerrel tovább hígítjuk, és így 1:10, ill. 1:100 térfogatarányú hígítást készítünk. Az egyes mintákat 45 másodpercig ultrahangbesugárzásnak vetjük alá, majd azonnal a megfelelő stabilizálószerrel hígítjuk 1:10 térfogatarányban. A stabilizálószer 6,7% szacharózt és 1% szarvasmarha-albumint tartalmaz foszfátpufferben oldva. A mintákat —70°C-on fagyasztjuk. A sorozatvizsgálatban a tízszeres hígításokat két szárított, 24 órás primer CEF sejttenyészetre oltjuk. Az oltás után 5 nappal meghatározzuk a foltok 4. táblázat Sejt: hígítószer térfogatarány Foltképző egység/ml (X106) a megadott mennyiségű albumint tartalmazó hígítószerben végzett besugárzás után 1% 0,5% 0,25% 0,l°/r 0,05% 1:5 1:10 1:100 Átlagos hozam/ml tömör sejttérfogat (FFUxlO6

) 5,5 5,5 6,0 5,5 2,3 (27,5) (27,5) (30,0) (27,5) (11,5) 1,4 1,8 2,2 2,8 i,o • (14,4) (18,0) (21,6) (27,6) ( 9,6) 0,17 0,24 0,26 0,28 0,14 (16,8) (24,0) (26,4) (27,6) (14,4) 19,6 23,2 26,0 27,6 11,8 Megjegyzés: a zárójelben megadott számadatok jelentése: 1 ml tömör sejttérfogatra vonatkoztatott foltképző egység tényező X 106 (foltok ml-enkénti száma X tényező X 106 számát. Az eredményeket a 4. táblázatban közöljük. A 4. táblázat adataiból megállapítható, hogy a sej - 30 tek és a hígítószer aránya nem döntő jelentőségű tényező (a hozamok a jelenlévő vírussejtek számának felelnek meg), és még 0,1 vegyes % mennyiségű albumin jelenlétében is megfelelő védőhatás biztosítható, sejtbontás alatt és után nagy vírus- 35 koncentráció érhető el. Látható az is, hogy 0,05% albumin jelenlétében is elérhető bizonyos mértékű védőhatás, ez azonban nem olyan nagy érték, mint a 0,1, ill. 1,0%-os koncentrációk esetén észlelt. 40 3. példa A találmány szerinti stabilizálószerek egyikében (szacharóz, foszfátpuffer és szarvasmarha-albumin) szuszpendált megfertőzött CEF sejtekből ultrahangbesugárzással sejtmentes FC—126 pulyka-herpes- 45 vírusokat szabadítunk fel, a szuszpenziót 1:10-arányban különböző koncentrációjú foszfátpufferes szacharóz- és szarvasmarha-albumin-oldattal hígítjuk, és az elegyet liofilizáljuk. A túlélő sejtmentes vírusok meghatározását a következőképpen végez- 50 zük: Pulyka-herpesvírussal (a 2. példa szerint előállított FC—126 törzzsel) megfertőzött primer CEF-sejttenyészeteket 7,6% szacharózt és 1% szarvasmarha-albumint tartalmazó foszfátpufferrel hígí- 55 tunk. A hígítás aránya: 1 térfogatrész tömör sejtanyag/20 térfogatrész hígítószer. A szuszpenziót 1,5 percen át ultrahangbesugárzásnak vetjük alá, majd éjszakán át —70 °C-on tartjuk. A fagyasztott anyagot felengedni hagyjuk, majd a sejtmentes 60 vírusszuszpenziót 1:10 arányban a következő négy hígítószer egyikével hígítjuk: 10% szacharóz foszfátpufferben, 10% szacharóz +1% albumin foszfátpufferben, 1% albumin foszfátpufferben, ül. ada- 65 lékanyagot, nem tartalmazó foszfátpuffer. A megfelelő mennyiségű, szacharózt és albumint is tartalmazó közeggel hígított szuszpenziót megfelelő menynyiségű, csak albumint tartalmazó közeggel hígított szuszpenzióval elegyítjük, és így különböző szacharóz-koncentrációjú, azonban azonos albumin-koncentrációjú szuszpenzió-sorozatot kapunk. Hasonló sorozatot állítunk elő a szacharóz adalékanyagot tartalmazó és az adalékanyagot nem tartalmazó foszfátpufferrel készített vírusszuszpenziók elegyítésével is. Az utóbbi szuszpenzió-sorozat végső albumin-koncentrációja 0,1%, ugyanis áz 1:10 arányú hígításhoz felhasznált vírusszuszpenzió eredetileg 1% albumint tartalmazott. Az elegyeket ezután 1 ml-es részletenként liofilizáljuk. A vizsgálatok céljára az egyes ampullákban lévő liofllizált anyagot 1 ml desztillált vízzel rekonstruáljuk, majd tízszeresére hígítjuk, és a hígított anyaggal két 24 órás, szárított primer CEF sejttenyészetet oltunk be. A beoltás után 5 nappal meghatározzuk a foltok számát, és minden mintára kiszámítjuk a foltképző egység/ml értéket. Az eredményeket az 5. táblázatban ismertetjük. 5. táblázat Végső szacharózFFU/ml az ; alábbi mennyiségű koncentráció albumint 1 tartalmazó szacharóz-i oldatokban 1,0% 0,1% 10% 44 400 43 200 8% 36 000 35 200 6% 45 600 56 000 4% 31200 44 800 2% 35 200 33 600 1% 14 000 13 600 7