166872. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amiláz előállítására
166872 3 4 tartalmazó táptalajon tenyésztjük, viszonylag rövid idő alatt érjük el az a-amiláz-termelés maximumát. Felismertük továbbá, 'hogy ha a kapott fermentlevet speciális tisztítási műveletsornak vetjük alá, a képződött a-amilázt egyszerű úton teljesen tiszta állapotban, kvantitatív hozammal különíthetjük el. Az a-amiláz elkülönítésére eddig alkalmazott tisztítási-feldolgozási műveletek nem vezettek tiszta termékhez, illetve a tiszta termék csak bonyolult műveletsorral, nagy veszteségek árán volt elkülöníthető. A találmány szerint .az a-amilázt Aspergilus oryzae penészgotmba (letétbehelyezési száma a Grúz Tudományos Akadémia Biológiai Intézeténél: 17) keményítőt, NaN03 -ot, MgS0 4 -ot KH2 P0 4 -ot, KCl-ot, FeS0 4 -ot, és malátacsíra extraktumot tartalmazó vizes tápoldatban, levegőztetéssel, szubmerz körülmények között való tenyésztésével állítjuk elő oly módon, hogy Aspergilus oryzae 3—9—15 mutánst (letétbehelyezési száma a Grúz Tudományos Akadémia Biológiai Intézeténél: 17) 50—90 g/liter keményítőt, 8—15 g/liter NaN03 -ot, 0,4—1,5 g/liter MgS0 4 ot, 0,2—1,2 g/liter KH2 P0 4 -ot, 0,5 g/liter KClot, 0,001—0,08 g/liter FeS04 -ot, 0,2—0,8 g/liter Mg(N03 ) 2 -ot, 0,1—0,7 g/liter Mg(H 2 P0 4 ) 2 -ot és 20 térf. % 20%-os malátacsíraextraktumot tartalmazó vizes tápoldatban végezzük, a kapott fermentlevet szűrjük, a szűrletet 0,0003—0,003 mólos, 6,5—7,5 pH-jú foszfátpufferrel dializáljuk, a kapott dializátumot dietilaminoetilcellulóz szorbensen bocsátjuk keresztül, és az a-amilázt előbb 0,04—0,09 mólos, 6,5—7,5 pH-jú foszfátpufferrel, majd 0,1—0,12 mólos, 6,5—7,5 pH-jú és 0,0003—0,001 mól/liter CaCl2 -ot tartalmazó foszfátpufferrel eluáljuk. A tenyésztést 28—32 C°-os hőmérsékleten 65— 80 órán át végezzük. A kapott fermentlevet a biomassza elválasztása céljából leszűrjük. Az aamilázt tartalmazó szűrletet 0,0003—0,003 mólos, 6,5—7,5 pH-jú foszfátpufferben dialízisnek vetjük alá. Foszfátpufferen a KH2 P0 4 és Na2HP0 4 sók keverékét értjük. A dialízissel az a-amilázoldatot a pigmentfestékek egy részétől, az ásványi savak maradékaitól és más Ikdsmolekulájú metabolitoktól szabadítjuk meg. A kapott, az említett anyagoktól -mentes dializátumot dietilaminoetilcellulóz szorbensen bocsátjuk át, az a-amiláz más fehérjaanyagofckal együtt teljesen megkötődik. Az a-amiláz extrakciójára, és a kísérő fehérjéktől való elválasztására a fenti foszfátpuffert alkalmazzuk, és az eluciót két lépésben végezzük. Először a szorbenst 0,04—0,09 mólos, 6,5— 7,5 pH-jú foszfátpufferrel kezeljük. Ebben a lépésben az a-amilázt kísérő fehérjeanyagok eluciója megy végbe. Ezután a szorbenst 0,1—0,12 mólos, 6,5—7,5 pH-jú, CaCl2 -ot 0,0003—0,001 mól koncentrációban tartalmazó említett foszfátpufferrel kezeljük, aminek következtében más fehérjeanyagoktól mentes a-amiláz-frakciót kapunk. Az elució említett sorrendjének betartása lényeges tényező, ami lehetővé teszi, hogy mintegy 100%-os kitermeléssel homogén a-amiláznak megfelelő fehérjeösszetételt kapjunk, ami az ismert eljárások szerint nem lehetséges. Ilyen módon a találmány szerinti a-amiláz előállítási eljárás csökkenti a technológiai művele-5 tek számát a japán kutatók által kidolgozott fentebb ismertetett eljáráshoz viszonyítva. A találmány szerint az a-amiláz mindössze négy lépéssel elkülöníthető, és a kapott termék teljesen tiszta. A találmány szerinti eljárás to-10 vábbi előnye, hogy rövidebb idő alatt teszi lehetővé az a-amiláz előállításai. A fermentációt 72 órán át folytatjuk. Az eközben elért a-amiláz aktivitást az ismert eljárásokkal mintegy kétszer ennyi idő alatt lehet elérni. 15 Az ilyen módon kapott a-amiláz liofilizálás után 0 C°-on 3 évig tárolva megtartja kiindulási aktivitásának több mint 90%-át. A találmányt a tárgyban járatos szakértők számára való jobb megértés érdekében az eljá-20 rás megvalósításának egy konkrét példájával mutatjuk be. Példa 25 Szubmerz inokulum előállítására a termelő Aspergillus oryzae 3—9—15 mutáns kémcsőben, 2% agart tartalmazó, 7%-os vizes sörcefreoldaton 10 nap alatt kifejlődött tenyészetének konidiumait steril csapvízzel kimossuk, és a rázólom-30 bikban levő, alábbi g/liter összetételű tápoldat 5—5 ml-éhez hozzáöntjük: keményítő — 60; NaN03 — 9,0; MgS0 4 — 1,0; KH 2 P0 4 — 1; KCl — 0,5; FeS04 — 0,03; Mg(N0 3 ) 2 — 0,2; Mg(H2 P0 4 ) 2 — 0,1 és 10 tf% 10%-os maláta-35 csíraextraktum. Az inokulumot 180/perc fordulatszámú rázóasztalon 30 órán át 30 C°-on rázatjuk. Ezután az inokulumot 0,5%-os mennyiségben sterilen betöltjük az 1000 literes fermentorba, amely 500 liter következő g/liter összeté-40 telű tápoldatot tartalmaz: keményítő — 80,0; NaN03 — 12,0 KH2P0 4 — 1,0; MgS0 4 — 1,0; KCl — 0,5; FeS04 — 0,03; Mg(N0 3 ) 2 — 0,8; Mg(H2 P04) 2 — 0,5 és 20 tf% 20%-os malátacsíraextraktum. 45 A fermentáció 30 C° hőmérsékleten 72 órán át történik. A fenmentor a levegő hozzávezetésére buborékoltatóval és keverővel wain ellátva. A bevezetett levegő mennyisége az első 24 óra alatt 250 l/perc, és a további időszakban 500 l/perc. 50 A habzás gátlására cetolajat használunk (olajsav és más habzásgátló használata lehetséges). A fermentáció befejezése után a gomba-biomasszát szűréssel (vagy szeparálással) elválasztjuk. A szubmerz tenyészet szűrletének a-amiláz-55 aktivitása 20 E/ml. A szűrletet dialízis céljából 0,003 mólos, 7,15 pH-jú foszfátpufferrel 12 órán át állni hagyjuk. A kapott dializátumot néhány egyenlő részre osztjuk, melyek egyenként 1000 mg fehérjét tartalmaznak 10 000 egység a-ami-60 láz-aktivitással. Ezeknek a részeknek mindegyikét egyenként 10 g dietilaminö-etilcellulóz szorbenssel töltött, 35 mm átmérőjű és 250 mm magas oszlopokon bocsátjuk át. Eközben az a-amiláz más fehérjeanyagokkal együtt a szorbensen 65 megkötődik. 2
