166802. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-tripszin-inhibitor tisztítására és dúsítására
3 rein-tripszin-inhibitornak szennyezett oldataiból történő tisztítására, továbbá dúsítására. A nyers inhibitor vizes oldatait amfotér ioncserélővel töltött oszlopba öntjük és foszfátpufferral beállítjuk. A nem adszorbeált anyagot foszfátpuffervagy sóoldatmosással távolítjuk el. Ezt követően az aktív anyag eluálása só-koncentráció-fokozatú oldatokkal történik. Az aktív frakciókat egyesítjük és a szokott módon sómentesítjük. Az erősen színes szennyezések, valamint az idegen antigén anyagok nagyrésze ennél a műveletnél egyszerű módon eltávozik. A kallikrein-tripszin-inhibitor eluálása 0,25 mólos nátriumklorid koncentrációnál, 6,2—8,0 pH értéknél, az inhibitor részére kíméletes feltételek mellett következik be. Az amfotér ioncserélőben a bázikus és savas csoportok közelsége a kallikrein-tripszininhibitor eluálás alatti magatartását előnyösen befolyásolja. A hatóanyag megkötése szempontjából meglepő az ioncserélő nagymértékű kapacitása. Ezt a tényt részben az ioncserélő makroporózus felépítése magyarázza. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi különleges tisztaságú kallikrein-tripszin-inhibitor előállítását, amelynek jelentősége, mint gyógyszer, ismert. Az eddig ismert eljárásokkal a KTI-t 0,17—0,2 jUg/KIE tisztasággal csak igen komplikált módon lehetett előállítani. így például az 1 084 433 számú NSZK-beli közzétételi irat szerint a szerv extrahálása után acetonos kicsapást alkalmaznak, majd oldják a KTI-t, a kísérő proteineket leválasztják szulfoszalicilsavval, és az oldatból a KTI-t metafoszforsav segítségével csapják ki. A csapadékot ezután elbontják és a kísérő anyagokat mégegyszer leválasztják triklórecetsavval. Az 1 168 605 számú NSZK-beli szabadalmi leírás szerint a szervet vizes perklórsavval extrahálják, a perklórsavat ezután káliumkarbonáttal semlegesítik és leszűrik a csapadékot. Az oldathoz annyi ammóniumszulfátot adnak, hogy az arra majdnem telítetté válik, a keletkező csapadékot leszűrik és vízben oldják. Ezt az oldatot először anioncserélő-gyantára, majd kationcserélő-gyantára viszik. Az inhibitort az utóbbiról savakkal eluálják. Ugyanakkor a találmány szerinti eljárással a polisztirol-alapú amfotér ioncserélő-gyanta alkalmazásával a KTI-t igen nagy tisztasággal és egyszerű módon kapjuk. 1. példa Az amfotér ioncserélő gyantát (lásd a 3. oldal 10—13 sorait) először 1 n nátriumhidroxid oldattal, desztillált vízzel, majd 0,5 n sósav oldattal és desztillált vízzel mossuk és feltöltjük. Ezt követően 0,01 mólos Na/K-foszfát-pufferrel a pH értékét 8,0-ra állítjuk be. Az így előkezelt 100 ml ioncserélőt oszlopba (2,5x20 cm) öntjük. A kovaföldön adszorbeált kallikrein-tripszin-inhibitort (lásd a 2. oldal 2. bekezdését) — amelynek tisztasági foka körülbelül 2000 KIE/mg (KIE = kallikrein-inhibitoregység) — vízzel extraháljuk. Az oldatot ioncserélők 4 váltakozó hozzáadásával (H + és CH~ alakban) 0,12 mS • cm-4 fajlagos vezetőképességre állítjuk be. Az 5100 KIE/ml tisztasági fokú oldatból 670 ml-t (összaktivitás 3,4 xlO6 KIE) 1,15 ml/perc/cm 2 5 sebességgel az oszlopon átfolyatunk. Az oszlopot 0,01 mól foszfát-pufferral mossuk és lineáris koncentráció-fokozatú oldatokkal , melyek 2 liter 0,01 mólos foszfát pufferből (pH 8,0), 2 liter 0,01 mólos foszfát-pufferből (pH 8,0) és 1,0 mólos nátrium -10 kloridból állanak, 0,35 ml/perc/cm2 sebességgel eluáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, ioncserélőkkel sómentesítjük és az oldatot liofilizáljuk. A kitermelés 87%, fajlagos aktivitás 6030 KIE/mg. (A KIE-egység definícióját lásd: Vogel, Trautschold 15 és Werle: „Natürliche Proteinasen-Inhibitoren, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1966, 6—7. oldal.) 20 2. példa Az amfotér ioncserélőt az 1. példában leírt módon feltöltjük és 0,01 mólos Na/K-foszfát pufferrel (pH 6,2) és 0,001 mól etiléndiamintetraecetsavval 25 (EDTA) beállítjuk. 100 ml ioncserélőt egy 2,5x20 cm méretű oszlopba töltünk. A 110,000 KIE/ml aktivitású (összaktivitás 2,2xlO6 KIE) és 4000 KIE/mg tisztaságú 20 ml Lewapol-gyantán kromatográfiásan előtisztított inhibitor-oldatot (eredetét 30 lásd a 2. oldal 2. bekezdésében) 0,35 ml/perc/cm3 sebességgel oszlopon átfolyatjuk. Az oszlopot 0,01 mólos foszfát-pufferrel mossuk és a hatóanyagot ezt követően 2 liter 0,01 mólos foszfát-pufferből (pH 6,2)+0,001 mólos EDTA-ból és 2 liter 0,01 mólos 35 foszfát-pufferből (pH 6,2)+0,001 mól EDTA-ból+ + 1,0 mólos nátriumklorid oldatból álló lineáris koncentráció-fokozatú oldatokkal eluáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, ioncserélőkkel sómentesítjük és az oldatot liofilizáljuk. A kitermelés 86%, a fajla-40 gos aktivitás 5000 KIE/mg. Az immun-elektroferogram egy kísérőantigén mellett egy sávot, míg a végtermék több sávot mutat. 45 3. példa Az amfotér ioncserélő-gyantát az 1. példában ismertetett módon feltöltjük és 0,01 mólos Na/K-50 foszfát-pufferral (pH 8,0) beállítjuk. A 7800 KIE/ml aktivitású (összaktivitás 10,1 X 106 KIE) és 2400 KIE/mg tisztasági fokú nyers, még erősen színezett (az 1. példában leírttal azonos) inhibitoroldat 1300 ml-ét 0,35 ml/perc/cm2 sebességgel egy 2,5 X 20 cm 55 méretű, 100 ml ioncserélővel töltött oszlopba viszszük. Miután az oszlopot 0,01 mólos foszfát-pufferral mostuk, nátriumkloridból álló lineáris koncentráció-fokozatú foszfát-pufferrel eluáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, ioncserélő-gyantán sómente-60 sítjük és az oldatot liofilizáljuk. Ilyen módon 1,58 g szilárd anyagot kapunk, melynek fajlagos aktivitása 5500 KIE/mg (összaktivitás: 8,68xlO6 KIE), ami 86%-os kitermelésnek felel meg. Az előállított termék színtelen, idegen antigénektől teljesen men-65 tes. 2
