166799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás BM123alfa,béta és gamma-antibiotikumok előállítására

166799 10 térfogat 1 liter. A gyantaoszlopot 4 liter vízzel mossuk. Az oszlopot 0,3 n kénsavval átmosva a BM123oc-t eluáljuk. Az eluátumot 500 ml-es frakciókban fogjuk fel. A BM123oc-t tartalmazó 1—7 frakciókat egyesítjük, majd az oldat pH-ját bárium- 5 hidroxid alkalmazásával 7,2 értékre állítjuk. A keletkező báriumszulfát-csapadékot szűréssel elkülönítjük. A tiszta szűrletet IRC—50 (H+) oszlopon engedjük át. Az oszlop ágytérfogata 650 ml. Az oszlopot vízzel mossuk és 0,3 n kénsavval fentiek io szerint eluáljuk. A hatóanyagot tartalmazó 1—7 frakciókat egyesítjük; báriumhidroxiddal a pH-t 7-re állítjuk. Az elegyet leszűrve tiszta oldatot kapunk. Az oldatot vákuumban betöményítjük, majd szénen kromatografáljuk. Darco G—60 (0,4—0,8 15 mm szemcseméretű) granulátumot szuszpendálunk a vízben, az; elegyet üvegoszlopba visszük, majd ülepedni hagyjuk. A víz feleslegét leszívatjuk, a BM123oc koncentrátumot az oszlophoz öntjük. Az oszlopot vízzel mossuk, majd 50%-os vizes metanol- 20 lal eluáljuk. A metanolos eluátumokat 50 ml-es frakciókban fogjuk fel. A 18—68-as frakciók tartalmazzák a hatóanyagot, ezeket egyesítjük, és vákuumban betöményítjük. A kapott koncentrátumot liofilizálva szilárd, fehér színű BM123oc terméket 25 kapunk. További hatóanyaghoz jutunk, ha a szénoszlopot 50%-os savas metanollal kezeljük. A kezeléshez 1,8 pH-jú kénsavoldatot alkalmazunk. További 16 frakciót gyűjtünk. A frakciókat egyesítjük, vákuumban betöményítjük. Az oldat pH-ját 30 báriumhidroxiddal 7,2-re állítjuk. Az elegyet szűrjük, majd liofilizáljuk. A BM123<x fizikai jellemzőit a 3. példa tünteti fel. BM123ß és BM123y-t termelő fermentációs folyamat A fermentációs folyamatot a BM123oe-nál leírtak szerint végezzük. Az inokulumkészítés is hasonló módon megy végbe. 35 40 Fermentáció BM123ß és BM123y előállítására A fermentációhoz az alábbi összetételű táptalajt alkalmazzuk: dextróz 10 g marhahúskivonat 4 g 45 Bacto-pepton 4 g nátriumklorid 2,5 g keményítő extraktum 1,0 g víz ad 1000 ml A táptalaj pH-ját nátriumhidroxiddal 7-es értékre 50 állítjuk. Az egyes tartályokat a fentiek szerint elkészített inokulummal oltjuk le. Az oltóanyag térfogata a fermentorban levő táptalaj 3—10%-át teszi ki. A táptalaj levegőztetését 0,2—0,8 liter steril levegő/ 55 táptalaj l/perc sebességgel végezzük. A keverés sebessége 50—200 fordulat/perc. A hőmérsékletet 25—29, célszerűen 28 °C-on tartjuk. A fermentációt 45—85 óra hosszat végezzük, majd a sejttömeget leszűrjük. 60 BM123ß és BM123y elkülönítése A BM123/?-t és y-t tartalmazó biomassza szűréséhez 1% diatóma földet alkalmazunk szűrési segéd- 65 anyagként. A micéliumpogácsát vízzel mossuk. A szűrletet a mosóvízzel egyesítjük, majd az oldatot egy 10 liter ágytérfogatú IRC—50 (Na+) gyantát tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. Az oldat átfolyási sebessége 330 ml/perc. A megtöltött oszlopot ezután vízzel mossuk, a hatóanyagot 0,3 n kénsavoldattal eluáljuk. Az eluátumot két részletben gyűjtjük öszsze. Az első részlet a 7—5 pH-jú frakciókat tartalmazza. Ezt a részletet magas sótartalma miatt nem használjuk fel. A második frakció pH-ja 1,4. Ezt a részletet báriumhidroxid alkalmazásával 6 pH-ra állítjuk. A képződő báriumszulfátot szűréssel eltávolítjuk. A szűréshez diatoma földet alkalmazunk. A szűrőpogácsát vízzel mossuk, majd a szűrletet a mosóvízzel egyesítjük. Az egyesített oldatokat vákuumban bepároljuk. A koncentrátumot 50°-os vízfürdőn hőkezeljük, majd forró Reinecke-sóoldathoz adjuk (150 mg/1500 ml; 75 °C). A forró oldatot mintegy 48 óra hosszat állni hagyjuk, majd szűrjük. Vörös színű szilárd terméket kapunk, amelyet vízzel mosunk. A szilárd anyagot víz-butanol 2 : 5 arányú elegye vei elkeverjük, majd a pH értékét 0,25 n kénsavoldattal 1,5-re állítjuk. Az elegyet szűrjük. A szűrlet pH-ját 6—8 értékre állítjuk. Ismételt szűrés után a szűrletet vákuumban betöményítjük. A koncentrátumot 100 ml Dowex 1x4 (Cl-) oszlopon bocsátjuk át, majd liofilizáljuk. BM123ß és BM123y kromatográfiás elválasztása 90%-os fenol-kloroform-piridin-ecetsav-víz 1500 : 300 : 45 : 45 : 750 arányú elegynek felső fázisát cellulózporral elkeverünk. A megnedvesített cellulózport részletekben üvegoszlopba töltjük. A liofilizált komponenseket a fent említett oldószer felső fázisában oldjuk és cellulózporral 1 : 2 térfogat/súly arányban elegyítjük, majd az oszlopra rétegezzük. Az oszlopra ezután nyomást adunk. 75 frakciót fogunk fel. Az egyes frakciók térfogata 25—25 ml. A hatóanyagnak a frakcióban való elhelyezkedését bioautográfiával ellenőrizzük. A vizsgálathoz fölcseppentett papírkorongot alkalmazunk. Ezt levegővel szárítjuk, éterrel mossuk, majd agarlemezre helyezzük. Az agarlemezen K. pneumoniae AD törzs van leoltva. Két hatóanyagsávot észlelhetünk. A BM123y-t tartalmazó sáv a 3—18 frakcióból származik. A BM123/3 sávot a 31—52 frakciókban lehet kimutatni. A 3—18 frakciókat egyesítjük és kloroformmal kirázzuk. Az alsó fázist elöntjük. A felső vizes fázis pH-ját 4,5-re állítjuk és azonos térfogatú éterrel kétszer extraháljuk. Ily módon a maradék fenolt eltávolítjuk. Ezt követően a vizes fázis pH-ját 6,5-re állítjuk, majd IR 45 (OH-) gyantán átbocsátjuk és a kapott oldatot liofilizáljuk. Ily módon BM123y hatóanyagot kapunk. A 31—52 frakciókat egyesítve, és a fentiek szerint eljárva BM123/? hatóanyaghoz jutunk. A három antibiotikumot in vitro vizsgálatnak vetettük alá. A vizsgálathoz számos Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumot, továbbá M. smegmatis-t használtunk fel. A vizsgálatot az ismert agarhígításos eljárással végeztük. Az eredményt a minimális inhibitorkoncentráció megadásával (mcg/ml) értékeljük. Az eredményeket a 6. táblázat foglalja össze. Összehasonlító anyagként gentamicin-szulfátot alkalmaztunk. D