166785. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anhidro-4-karbamoil-5-hidroxi-1-ribofuranozil-imidazoliumhidroxid előállítására

6. táblázat: Bredinin Imuran Kontroll Adag Kezelt egerek száma Túlélő/kezelt 25 25 5 fiziológiás sóoldat 10 10 10 10 40 8/10 7/10 10/10 6/10 4/40 Amint a fentiekből látható, az egerekben influenzavírussal előidézett fertőzés kezelésében a bredinin hatásosnak bizonyult, és gyógyító hatása csaknem azonos az imuránéval. A fertőzés után 15 nappal a kontroll egerek 90%-a elpusztult, míg a 25 mg/kg, illetőleg 5 mg/kg adagot kapott egerek elhalási arányszáma 20%, illetőleg 30% volt. A bredinin hatása nem a vírus szaporodásának gátlásában, hanem az influenzavírussal szembeni sejtimmunitás csökkenésében nyilvánul meg. 5. Daganatellenes hatás: A bredinin hatása egerekben az Ehrlich-féle hasvízkór- (ascites-) daganattal és L—1210 leukémiával szemben gyenge. A következő példák szemléltetik a találmányt. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban közöljük. 1. példa 2% glukózt, 10% burgonyakivonatot (300 g szeletelt burgonyából és 1 liter vízből egyórai főzéssel készül), 0,5% gyapotmaglisztet, 0,5% káliumhidrogénfoszfátot és 0,75% magnéziumszulfátheptahidrátot tartalmazó 100 ml 6,5 pH-jú tápközeget 500 ml-es lombikban 120°-on 15 percig sterilizálunk. Ezt a táptalajt beoltjuk Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 spóráival, és percenként 300 fordulattal forgatva-rázva 26°-on inkubáljuk. 48 óra elteltével a táptalajt 30 literes fermentátorban levő 20 liter fenti összetételű táptalajba öntjük, és percenként 300 fordulattal keverve, percenként 20 liter levegő átáramoltatásával 49 óra hosszat tovább inkubáljuk. Az így kapott fermentlét 300 literes rozsdamentes acél fermentálókádban levő 200 liter előzetesen sterilizált, 6,5 pH-jú, 2% glukózt, 1% peptont, 1% kukoricalekvárt, 0,2% káliumdihidrogénfoszfátot, 0,1% magnéziumszulfát-heptahidrátot, és 0,1% habzásgátló szert tartalmazó táptalajba viszszük át, és percenként 350 fordulattal keverve, percenkint 200 liter levegővel levegőztetve, 55 óra hosszat 26°-on fermentáljuk, mire 50 /ig/ml bredinint tartalmazó, 5,9 pH-jú fermentlét kapunk. A fermentlé pH-ját 50%-os vizes nátriumhidroxidoldattal 9,0-ra állítjuk be, majd leszűrve 170 liter víztiszta szüredéket kapunk. A szüredéket az anyag adszorbeálására percenként 300 ml sebességgel átbocsátjuk egy 20 liter Amberlite IRA 411 (OH-166785 típusú) gyantával töltött 15 cm átmérőjű oszlopon, és azt 50 liter vízzel mossuk. Az eluálást 2%-os vizes ecetsavval végezzük, és az eluátumot 5 literes frakcióként gyűjtjük. 5 Kísérleti mikroorganizmusként Candida albicanst használva a 7—9. frakciókat találjuk aktívnak. Ezeket egyesítjük, a pH-t 50%-os vizes nátriumhidroxid-oldattal 9,6-ra állítjuk be, majd az oldatot átbocsátjuk egy 4 liter Amberlite IRA—411 1.0 (OH típusú) gyantával töltött 7,5 cm átmérőjű oszlopon, azt vízzel mossuk, és 2%-os vizes ecetsavval eluálva 500—500 ml-es frakciókat fogunk fel. A 13—18. frakciókat találjuk aktívnak, ezeket egyesítjük, és az oldatot vákuumban bepárolva 200 ml 15 olajos maradékot kapunk. A maradékot 400 ml metanollal és 200 ml acetonnal jól elkeverjük, és a kivált csapadékot percenkint 3000 fordulattal 10 percig centrifugáljuk. A csapadékot acetonnal mosva, és vákuumban szárítva szürkésfehér por-20 ként 50 g nyers bredinint kapunk (tisztasági foka 10%). 2. példa 25 Az 1. példában kapott nyers bredinin port kevés vízben oldjuk, és 10 : 1 : 2 térfogatarányú n-butanol—ecetsav—víz oldószerkeverékben szuszpendáljuk, majd 4,0 cm átmérőjű, 500 ml 0,30—0,40 mm 30 szemcseméretű kovasavgéllel töltött és 10 : 1 : 2 térfogatarányú n-butanol—ecetsav—víz oldószerkeverékkel nedvesített oszlopra töltjük, és ugyanezzel az oldószerkeverékkel eluáljuk. Az eluátumot 100 ml-es frakciókként fogjuk fel. Az ibolyaszínű 35 5—7. frakciókat találjuk aktívnak. Ezeket egyesítjük, és vákuumban bepárolva 14,3 g sötét ibolyakék port kapunk (tisztasági foka 26%). Ezt a port 100 ml vízben oldjuk, és a kelátképző fémek szulfid alakban való leválasztására hidrogénszulfiddal 40 telítjük. Bepárlás után a száraz anyagot 10 ml 0,1 mól-os 6,0 pH-jú piridin-ecetsav pufferoldatban oldjuk, és 400 ml DEAE-Sephadex-A-25 gyantával töltött és ugyanilyen pufferoldatot tartalmazó, 2 cm átmérőjű oszlopra töltjük. Az eluátumot 45 10 ml-es frakciókként fogjuk fel, és az aktívnak talált 70—135 számú frakciókat egyesítve és vákuumban bepárolva 1,8 g fehér port kapunk. Tisztasági foka 90%. Forró metanolból átkristályosítva 1,1 g kristályos bredinint kapunk. Tisztasági 50 foka 100%. Szabadalmi igénypont: 55 Eljárás az I képletű anhidro-4-karbamoil-5-hidroxi-1-ribofuranozil-imidazóliumhidroxid előállítására azzal jellemezve, hogy Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 mikroorganizmus törzset asszimilálható szenet és asszimilálható nitro-60 gént tartalmazó táptalajon aerób körülmények között tenyésztünk, és a keletkezett I képletű terméket elkülönítjük. 1 rajz A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 4 76.0076 — Kossuth Nyomda, Budapest. F. v.: Monori István vezérigazgató