166785. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anhidro-4-karbamoil-5-hidroxi-1-ribofuranozil-imidazoliumhidroxid előállítására
166785 nyésztés időtartama a körülményektől függ, előnyösen 40—70 óra lehet. A tenyésztést akkor kell befejezni, amikor a bredinin a táptalajban a legnagyobb aktivitást érte el. A bredinin a folyékony szüredékben van; a mi- 5 célium-szűrólepény nem tartalmaz bredinint. Mivel a bredinin vízben oldható, csaknem minden szerves oldószerben rosszul oldható, és különösen a vízzel nem elegyedő szerves oldószerekben oldhatatlan, szerves oldószerekkel lehetetlen extrahálni. 10 Ennélfogva elkülönítésére előnyösen enyhén savas természetét vagy szerves oldószerekben való oldhatatlanságát hasznosíthatjuk. Mivel a bredininnek gyenge mikrobaellenes hatása van, a szokásos csészemódszerrel határozható meg, kísérleti mikro- 15 organizmusként Candida albicanst használva. A bredinin elkülönítését és tisztítását például a következőképpen hajthatjuk végre: az Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 tenyészetének 20 szüredékét beállítjuk 9,0 pH-ra, és a bredinin adszorbeálására átbocsátjuk egy hidroxi típusú, erősen bázisos anioncserélő gyantán, például Amberlite IRA—411 gyantán, majd azt 2%-os vizes ecetsavoldattal eluáljuk. Az eluátumot kívánt esetben 25 újra kezeljük az erősen bázisos anioncserélő gyantával, majd az eluátumot vákuumban bepárolva olajos maradékot kapunk, amelyet metanol és aceton hozzáadásával szürkésfehér porrá dörzsölünk szét. A port kevés vízben oldjuk, és az oldatot ko- 30 vasavgéllel töltött oszlopon kromatografálva ibolyaszínű aktív frakciókat kapunk: ezeket vákuumban bepároljuk. Az így kapott port vízben oldjuk, majd kelátképző fémek felszabadítására hidrogénszulfiddal telítjük. A további tisztításra a nyers 35 bredininport 0,1 mólos piridin-ecetsav pufferoldatban oldjuk, és ezt az oldatot DEAE-Sephadex A—25-tel (térhálósított dietilaminoetildextrán-gél) töltött oszlopon átbocsátjuk. Az eluátum aktív frakcióiból a bredinin metanol hozzáadására fehér 40 kristályokban kiválik. A bredinin fizikai-kémiai tulajdonságai: 1. Elemi összetétel, %: C: 41,70;, H: 5,06; N: 16,21; 0: 37,03. 45 2. Molekulasúlya: talált: 265 (titrálással), számított: 259,22 a C9 H 13 N 3 0 6 képlet alapján. 3. Olvadáspontja: >200 °C (bomlik, barnára színeződik). 4. Optikai forgatóképessége: 50 [a ]27 = _35° (c = 0,8 vízben). 5. Ultraibolya abszorpciós spektruma (vízben): Aroax : 245 m/i, E& = 250; Amax : 279 m /í; Ei% m = 580. 6. Infravörös abszorpciós spektruma (KBr tab- 55 letta): abszorpciós sávok 3420, 3130, 2925, 2770, 1625, 1540, 1445, 1300, 1260, 1195, 1030, 1100, 1080, 1055, 980, 873, 829, 770, 740, 725, 560 cm^1-nél. 7. Színreakciók: 60 pozitív színreakciót ad vas(III)kloriddal, Molischreagenssel, káliumpermanganáttal, Pauli- és Ehrlich-reagenssel. Negatív a reakció Tolens, Fehling, Dragendorf, Leidon—Smith, izatin, Sakaguchi és ninhidrin próbákban. 65 8. Oldhatósága: vízben könnyen oldódik, metanolban kevéssé oldódik, etanolban alig oldódik, a szokásos szerves oldószerekben oldhatatlan. 9. pKa: gyengén savas (pKa 6,75.) 10. Megjelenése: fehér kristályok. 11. Stabilitása: 2—9 pH-nál 60 °C-on 30 perc alatt nem inaktiválódik. A bredinin kémiai szerkezete a röntgendiffrakciós elemzéssel kapott eredménnyel megegyezően feltehetően az I képlettel fejezhető ki, bár más elméletileg ésszerű szerkezeti képletek is elképzelhetők. A bredinin biológiai tulajdonságai: 1. Toxicitás: a) Akut toxicitása: >2,4 g/kg (egerekben intraperitoneálisan). Egy hétnél hosszabb ideig tartó túlélést észleltünk, amikor 4 napon át napi 500 mg/kg bredinint intraperitoneálisan adtunk be. b) Vérkép megfigyelése folyamatos adagolás alatt: Az 1. táblázatban összefoglaltuk a 8 napon át egerekbe bredinin és imurán beadása után észlelt vérképadatokat. 1. táblázat: FehérVörösvérsejtHemovérsejtszámlálás globin számlálás (mm3 ) (mm3 ) g/10 ml 5200 9240 X 103 8,7 Kontroll 7400 9170 X 103 9,2 4700 8210 X 103 9,4 5900 9810 X 103 11,0 Bredinin 4900 8770 X 103 10,1 napi 100 : mg/kg 6600 7930 X 103 8,8 1900 6200 X 103 7,0 Imurán 1800 7580 X 103 6,8 napi 100 mg/kg 2600 6400 X 103 7,2 Amint az 1. táblázatból látható, a bredinin a fehérvérsejtek számát kevésbé csökkenti, mint az imurán. 2. Antimikrobális hatás: A bredininnek nincs antimikrobális hatása, de a Candida albicans tenyészését kissé gátolja. o, Immunszuppressziós hatás: a) Bredinin 4 napig tartó folyamatos adagolása után: Tíz ddY törzsbeli hím egérből álló három kísérleti csoport mindegyik egyedébe intravénásán befecskendeztünk 4 X 108 birka vörösvértestet. (A továbbiakban ezt BWT-nek nevezzük). Ezután két csoportnak intraperitoneálisan 4 napon át napi 50 mg/kg, illetőleg 100 mg/kg bredinint adtunk be. A BWT immunizálás után 4 nappal meghatároztuk a hemolizin titert, és megszámláltuk a lépben a plakk-képző sejteket. Az eredményekot a 2. táblázatban közöljük. 2
