166686. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, hipokalcémiás hatású dotriakontapeptidamidok előállítására
71 166686 72 TMaCl 2,0 mg 0,5 n NaOH-oldat pH 8,6 értékig desztillált vízzel 1,0 ml-re töltve. 8. példa Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Ile-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (dezamino Cys1 -Ile 8 -kalcitonin M. dihidroklorid) 37 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Ile-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOG)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet egy kis lombikban jégfürdőn nitrogénatmoszférában 0°-ra hűtünk, majd hozzáadunk 1,1 ml tömény sósavat és teljes feloldódás után (melynek időtartama körülbelül 1 perc) még 7 percig keverjük 0c -on. Ezt követően nagyvákuumban bepároljuk, az üvegszerű maradékot 2 ml vízben oldjuk és liofilizáljuk. Cellulózon vékonyrétegkromatogramban a kapott dotriakontapeptidamid-dihidroklorid Rf értékei a következők: Rf52 = 0,15; az n-butanol-piridin-jégecet-víz (42 : 24 : 4 : 30) rendszerben Rf = 0,75. A kiindulási anyagot a következőképpen állíthatjuk elő: l.Z-Ile-Gly-OMe 47,4 g H-Leu-Gly-OMe vegyületet 250 ml dimetilformamidban oldunk, az oldatot összekeverjük 2,68 ml jégecettel és 90,5 g Z-Ile-ONP vegyülettel, majd a reakció keveréket 18 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Bepárlás után a maradékot 1,5 liter etilacetátban és 0,5 liter n-butanolban oldjuk, majd az oldatot semleges kémhatásig mossuk. A bepárlás után kapott termék szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatánál toluol-aceton (1 : 1) rendszerben Rf = 0,50. 2. TRI-Cys(TRI)-Ile-Leu-Gly-OMe Az 1. pont szerint kapott terméket metanolban hidrogénezzük 10%-os palládiumszén katalizátor jelenlétében. A kapott H-Ile-Leu-Gly-OMe vegyület 1,75 g-ját 20 ml acetonitrilben 4,7 g TRI-Cys(TRI)-OH vegyülettel kondenzáljuk 1,9 g diciklohexilkarbodiimid jelenlétében. A termék Rf értéke szilikagélen kloroform-metanol (9:1) rendszerben 0,77. 3. H-Cys(TRl)-Ile-Leu-Gly-OMe A 2. pont szerint kapott termékből az N-tritil-csoportot 36,3 ml jégecettel és 6,3 ml vízzel lehasítjuk. A termék vékonyrétegkromatográfiásan vizsgálva, szilikagélen kloroform-metanol (98 : 2) rendszerben Rf = 0,22. 36 4. DPC-Ser(tBu) Thr(tBu)-Cys(TRI)-I!e-Leu-Gly-OMe 1,60 g DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH2 vegyületet 5 13 ml dimetilformamidban oldunk, az oldatot —15°-ra hűtjük és hozzáadunk 3,5 ml 2 n sósavas etilacetátot, valamint 0,39 ml terc-butilnitritet. Az oldatot 15 percig — 10°-on állni hagyjuk, majd — 20°-ra hűtjük. Ezután gyorsan hozzácsepegtetjük 2,55 g H-Cys(TRI)-Ile-Leu-10 -Gly-OMe vegyület, valamint 0,975 ml trietilamin 9 ml dimetilformamiddal készített és 0c -ra lehűtött oldatát. A kapott oldatot 1 órán át — 10°-on keverjük és 18 órán át 0°-on állni hagyjuk. A terméket az 1. példa 13. pontjában leírtakkal azonos módon különítjük el. Szilika-15 gélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során toluol-aceton (6 : 4) rendszerben Rf = 0,55; kloroform-metanol (97 : 3) rendszerben Rf = 0,40. 20 5. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Ile-Leu-Gly-OMe A 4. pont szerint előállított termék 1,66 g-ját 45°-on 8,9 ml jégecetben oldjuk, keverés közben 2,2 ml vizet csepegtetünk hozzá és az oldatot 75 percig 45°-on állni 25 hagyjuk, majd vízlégszivattyúval létesített vákuumban bepároljuk. A maradékot 10 ml metanolból 35 ml etilacetátból és 300 ml petroléterből végzett újbóli kicsapással tisztítjuk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatogramban kloroform-metanol (7 : 3) rendszerben Rf = 30 0,82; Rf43C = 0,73. 6. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Ue-Leu-Gly-OH 35 Az 5. pont szerint kapott termék 802 mg-ját 11 ml dimetilformamiddal elegyítjük, 50°-ra melegítjük, finoman szuszpendáljuk, majd 2,7 ml vizet adunk hozzá, eközben fehér, finom pelyhekből álló csapadék válik ki. A szuszpenziót szobahőmérsékleten erős keverés mellett 40 2,4 ml 1 n nátriumhidroxidoldattal elegyítjük és 10 percig szobahőmérsékleten tovább keverjük. A kapott oldatot 0°-on 2,4 ml 1 n sósavoldattal, valamint 8 ml vízzel elegyítjük, a kivált csapadékot 90 percig keverjük 0c -on, majd szűrjük, vízzel kloridmentesre mossuk és metanol-45 -kloroform-petroléter elegyéből újból kicsapjuk. Szilikagélen vékonyrétegkromatogramban Rf43C = 0,40 kloroform-metanol (7 : 3) rendszerben Rf = 0,33. 50 7. Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Ile-Leu-Gly-OH 3,79 g Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2 vegyületet (v.o. 737 890 sz. belga szabadalmi leírás) 50 ml dimetil-55 formamidban oldunk, az oldatot — 10°-ra hűtjük, lassan hozzácsepegtetünk 6,81 ml 2,15 n sósavas etilacetátot, majd 0,69 ml terc-butilnitritet. 15 perc után — 10°-on hozzáöntjük 5,48 g H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Ile-Leu-Gly-OH, valamint 2,85 ml dimetilformamiddal 60 készített és — 10°-ra lehűtött oldatát. A reakciókeveréket 2 órán át — 10°-on, majd 15 órán át 0°-on állni hagyjuk, ezt követően nagyvákuumban körülbelül 30 ml térfogatra bepároljuk és 100 ml metanollal elegyítjük. A szuszpenziót 5 percen át 40°-ra melegítjük, majd 0°-ra 65 hűtjük, szűrjük és a csapadékot 50 ml hideg metanollat
