166650. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lipáz előállítására mikrobiológiai úton

5 166650 6 A találmány eljárás lipáz előállítására, amely abban áll, hogy a Cfiromobacterium genus-ba tartozó lipáztermelő baktériumot tenyésztünk és az így tenyésztett termékekből lipázt különítünk el. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítasi módja szerint úgy járunk el, hogy a Chromobacterium genus-ba tartozó olyan baktériumot, amely lipáz-termelő képességgel rendelkezik, táptalajon tenyésztünk. A felhasználható táptalajok megegyeznek a szakmában általánosan használtakkal. Szénforrásként pl. bármilyen asszimilálható szénvegyület felhasználható, így pl. glükóz, szacharóz, laktóz, maltóz, oldható keményítő, natív keményítő, dextrin, melasz és hasonlók. Nitrogénforrásként bármilyen a szakmában általánosan használt nitrogénforrás felhasználható, így pl. szójaliszt, zsírmentesített szójaliszt, gyapotmagliszt, pepton, élesztőkivonat, porított száraz élesztő, kukoricalekvár, kazein-hidrolizátum, karbamid, ammóniumsók stb. A táptalajhoz adott szervetlen sókként foszforsavsókat, előnyösen magnézium-, kalcium- és káliumsókat használhatunk. Természetesen adhatunk a táptalajhoz különböző szerves és szervetlen anyagokat is, amelyek szükségesek a baktérium növekedéséhez és a kívánt enzim termeléséhez. Megállapítottuk, hogy amikor állati vagy növényi zsírt és/vagy olajat adunk a tápoldathoz, lényegesen javítható a lipáztermelő hatékonyság. Ilyen célra állati zsírokat és olajokat, így pl. disznózsírt, faggyút, vajat, bálnaolajat, halolajat és hasonlókat használhatunk. Növényi olajként pl. olívaolajat, szójaolajat, gyapotmagolajat, szezámolajat, repceolajat, kókuszolajat, földimogyoróolajat és hasonlókat használhatunk. Ezeket a zsírokat és/vagy olajokat általában a táptalaj mennyiségére vonatkoztatva 0,5—5 súly% mennyiségben használhatjuk. A szilárd zsírokat, így a disznózsírt, faggyút, vajat és hasonlókat természetesen megolvasztja az a hő, amelyet a táptalaj előzetes sterilizálása alatt közlünk az anyaggal, és így az ilyen zsírok is egyenletesen eloszlathatok a táptalajban és a mikroorganizmusok által jól hasznosíthatók. A találmány szerinti eljárás foganatosítására egyaránt lehet használni szilárd vagy folyékony táptalajon végzett tenyésztést. Ipari célra azonban a folyékony tápoldat alkalmazása előnyös lehet a szubmerz levegőztetés előnyeivel. A tenyésztési hőmérsékletet előnyösen 24—28 C°-ra állítjuk be, és a tenyésztés időtartama általában 2—6 nap. Csupán arra van szükség, hogy a tenyésztést akkor fejezzük be, amikor a lipáz-termelés maximális értéket ér el. Ezt követően a pH-érték nem változik, így annak beállítása általában szükségtelen. Nagyon előnyös azonban a pH-t 6 és 7 közötti vagy ehhez közeli értékre állítani a tenyésztés kezdeti időszakában. A lipáz termék elkülönítését és tisztítását a szokásos eljárásokkal végezhetjük. Amikor szilárd táptalajt használunk, a termékeket a szokásos extraháló reagenssel, így vízzel extrahálhatjuk, és így a kívánt extraktumot kapjuk. Ezzel szemben, amikor folyékony táptalajt használunk, a tenyészoldatot a szokásosan használt elkülönítési eljárásnak kell alávetni, így pl. csökkentett nyomáson végzett szűrésnek vagy centrifugálásnak a gombatestek elkülönítése céljából. Az így kapott szüredéket vagy extraktumot azután kondenzálhatjuk, vagy a termékeket oldható só, így konyhasó, ammóniumszulfát, vagy vízzel elegyedő szerves oldószer, így etanol, aceton stb. hozzáadásával a szokásos módon kicsaphatjuk. Egy további eljárásmód szerint a szüredéket vagy kondenzátumot stabilizálószer, így maltodextrin, laktóz, karboximetilcellulóz, polietilénglikol, lefölözött tej, 5 kazein, szorbit és/vagy hasonlók előzetes hozzáadása után porlasztva száríthatjuk. További lehetőség a liofilizálás, ioncserés adszorpció, gélfiltrálás alkalmazásában vagy e műveletek kombinált alkalmazásában áll. Ilyen módon lipáz-aktivitású enzimport kaphatunk nyers ter-10 mékként. A találmány szerinti eljárással előállított lipáz stabilis és nagy hatékonyságú. Ilyen vonatkozásban az 1. példa szerinti módon kapott nyers lipáz-port az alábbiakban részletesebben ismertetjük. 15 A pH-változás függvényében vizsgálva a stabilitást megállapítottuk, hogy a lipáz-por aktivitása 80% vagy magasabb, 24 órán át 20 C°-on 4,0 és 9,0 közötti pH-n való tartás után. Még 3 és 10 közötti pH-n is 70% vagy magasabb volt a maradék-aktivitás. Optimális haté-20 konyság 4,0 és 9,0 közötti széles pH-tartományban mutatkozott. A maximális hatékonyság 6—7-es vagy e körüli pH-n mutatkozott. Ha a nyers termék hatékonyságát 6-os pH-n 100-nak vesszük, 4-es vagy 9-es pH-n ez az érték 80, míg 10-es pH-érték mellett 70, és 25 3-as pH-érték mellett 40. A maradék-aktivitás hőkezelés hatása alatti stabilitása 37 C° és 95 C° között, különösen 80 C° alatti hőmérsékleten végzett hőkezelés alkalmazásakor meghaladta a 90%-ot, és még 90 C°-on is 60% volt, ami a lipáz nagy hőstabilitását bizonyítja. Maximá-30 lis hatékonyság 50 C° körül mutatkozott. Minthogy a találmány szerinti eljárással készített lipáz erősen stabilis és hatékony, a lipáz enzimet még nyers állapotban, közvetlenül az előállítási eljárás alkoholos ülepítő lépése után is jól lehet hasznosítani nem-35 csak emésztést segítő anyagként, hanem detergensként vagy sterilizálószerként vagy hatékony ilyen adalékként, vagyis így lényegesen szélesebb körű lipáz-hatékonyságot kapunk. Az 1. táblázatban az alkoholos ülepítési lépéssel ka-40 pott nyers lipáz-por összehasonlító vizsgálati eredményeit mutatjuk be, a lipáz bontóképességét különböző olajokkal és zsírokkal kapcsolatban ismertetve. 1. táblázat A bontás Szubsztrátum mértéke Olívaolaj 1,0 Gyapotmagolaj 0,90 Gumimag-olaj 0,86 Szójababolaj 2,20 Földimogyoróolaj 0,90 Repceolaj 0,90 Disznózsír 2,0 Faggyú 1,2 Vaj 1,2 Tween 60 0,50 Megjegyzés: 24 térf.rész vizet alaposan elegyítettünk 1 térf. rész szubsztrátummal, és 1 g szubsztrátumra számítva 37,5 mg nyers lipáz-port adtunk hozzá, majd 7,0 pH-n 30 C°-on 65 10 órán át kezeltük. 3