166603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cellulóztriacetát szálba zárt enzimkészitmények előállítására

3 166603 4 zárt, nagy aktivitású enzimkészítmények előállítása. Kísérleteink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy e cél elérhető, ha a polimer szál alapanyagaként használt cellulóztriacetáthoz (Fluka gyártmány, 43,7% acetil tartalom, sűrűség 1,23) az oldás alkalmával a cellulóztriacetátra számítva 30— 120 s% mennyiségben egy szerves foszforsavésztertípusú vegyületet adunk, majd a szokásos módon elvégezzük az enzimoldat emulgeálását, a szálképzést és a szál kicsapódását. Ez a felismerés azért meglepő, mert a foszforsavészterek lágyító hatású adalékok, amelyek hozzáadásától nem várható a műszálak tulajdonságainak javulása. Különösképpen meglepő az elért hatás az adott esetben azért, mert a szál megszilárdítása kicsapófürdővel történik, amely kioldja a szál anyagából a foszforsavésztereket. Infravörös elemzéssel valóban kimutatható, hogy a kicsapófürdős kezelés során a szál csaknem teljesen elveszíti foszforsavészter-tartalmát. Ennek ellenére a foszforsavészter-adalékkal előállított szál lényegesen rugalmasabb az a nélkül előállított szálnál; ugyancsak nagyobb az így előállított szál enzimaktivitása, mégpedig nagyobb molekulájú szubsztrátumokkal szemben is. Feltételezzük, hogy a foszforsavészter-adalék az emulgeálás és a szálképzés folyamán a polimer molekulákat olyan kedvező helyzetbe hozza, amelyet azok a későbbiek folyamán, amikor a foszforsavészter molekulák helyét a kicsapószer molekulái foglalják el, továbbá a felhasználás során sem veszítenek el. Jelen pillanatban nem tudjuk kielégítően magyarázni azt a jelenséget, hogy a találmány szerint előállított enzimkészítmények stabilitása kedvezőtlen hőmérsékleti és pH viszonyokkal szemben meglepően nagy a natív enzimmel és a más módon előállított kötött enzimkészítményekkel összehasonlítva. Fentiek alapján a találmány eljárás enzimaktivitással rendelkező cellulóztriacetát alapú szálak előállítására, a cellulóztriacetát oldatában adott esetben adalékanyagokat tartalmazó vizes enzimoldatnak vagy enzimhatású szuszpenziónak az emulgeálása, majd az emulzióból szál húzása és a szálnak kicsapófürdőben való megszilárdítása útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a cellulóztriacetát alapanyaghoz annak oldása során 30—120 súlyszázalék mennyiségben szerves foszforsavésztert adunk. Szerves foszforsavészter-adalékként célszerűen trikrezilfoszfátot használhatunk. Abban az esetben, ha a szál megszilárdítását nem kicsapófürdővel, hanem az oldószer elpárologtatásával végezzük, sem a szál szilárdsága, sem enzimaktivitása nem lesz megfelelő. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők : a) Az eljárással előállított termék mechanikai igénybevétellel, mozgatással vagy áttekercseléssel járó ismételt felhasználásra alkalmas; segítségével kivitelezhetők a szál és az oldat egyidejű mozgatásával járó ellenáramú eljárások is. b) Az eljárással előállított termék csekély diffúziós ellenállást jelent a szubsztrátum-molekulák számára. c) Az eljárással előállított termék pH- és hőtűrése jelentősen megnövekedett mind a natív enzimmel, mind pedig az egyéb eljárásokkal előállított kötött enzimkészítményekkel szemben. A találmány szerinti eljárást a következő kiviteli példákkal világítjuk meg: 1. példa 100 g cellulóztriacetátot és 80 g trikrezilfoszfátot oldottuk 820 g metilénkloridban. Hozzáadtunk 200 000 egység penicillinaciláz enzimet, 65 ml 8-as pH-jú pufferoldatban és 35 ml glicerinben oldva. E keverékből lassú keveréssel emulziót készítettünk, majd az emulzióból 1000-szer 80 mikron lyukméretű fonófejen keresztül szálat húztunk. A szálat 20 C° hőmérsékletű toluolos kicsapófürdőn áthúzva megszilárdítottuk és feltekercseltük. A légszáraz szál átmérője 20 mikron volt. A szál a bevitt enzim penicillinbontó aktivitásának 90%-át mutatta. A penicillinbontó aktivitás meghatározása a következő eljárás szerint történt: 50 ml 0,1 mólos pH = 8 trietilaminfoszforsav pufferbe helyeztünk 2 g enzimszálat, 40 C°-ra termosztáltuk, majd 2 g G-penicillin-K szubsztrátot adtunk hozzá és 30 perces bontást végeztünk. Inkubálás után az oldat 1 ml-ét kiráztuk 50 ml butilacetáttal és glicin pufferrel. A keletkezett 6 aminopenicillánsav mennyiségét a lúgos hidrolízis után jódfogyasztás alapján állapítottuk meg. A szál az aktivitását 100 egymást követő mérési ciklusban megtartotta; az egyes mérési ciklusok között a szálat a mérőoldatból kivettük, kinyomkodtuk, és pufferoldaton való többszöri áthúzás közben mostuk. A szál aktivitása 30 percig tartó 13-as pH-jú kezelés hatására gyakorlatilag változatlan maradt; ezzel szemben a natív enzim aktivitása 30 percen át 10-es pH-n végzett kezelés hatására közel nullára csökkent. 2. példa Mindenben az 1. példa szerint jártunk el, azonban a cellulóztriacetát és trikrezilfoszfát metilénkloridos oldatába 0,5 g alkalikus proteázt vittünk be, 70 ml 7,5-es pH-jú puffer és 30 ml glicerin keverékében oldva. Az emulzióból előállított szálak N-benzoil-L-arginin-etilészter-hidroklorid szubsztrátummal szemben a bevitt enzim aktivitásának 95%-át mutatták. Az enzimaktivitás meghatározását J. Mond, Pharm., 1, 11 (1968) 33—36 oldal szerint végeztük azzal a módosítással, hogy 0,5 g enzimszállal mértünk, s ehhez a reagensekből az irodalom szerint megadott mennyiség ötszörösét vettük. A szál 1 órán át 75 C°on végzett hőkezelés után a bevitt enzim aktivitásának 90%-át mutatta, míg a natív enzim aktivitása hasonló kezelés után nem volt mérhető. 3. példa 100 g cellulóztriacetátot és 60 g tri-izobutilfoszfátot oldottunk 820 g metilénkloridban. Hozzáadtunk 65 ml desztillált vízben és 35 ml glicerinben oldva 0,1 g tripszint (Trypure, NOVO gyártmány, 25 Anson tripszin egység/g). Az enzimoldatot lassú keveréssel a polimeroldatban emulgeáltuk, majd az 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2