166530. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antipepszin hatású pepsztrationok előállítására
3 166530 4 hívás Rydon—Smith színreakcióval.) A pepsztatin B metilészterének antipepszin-hatása megegyezik a pepsztatin metilészterének hatásával. Kísérleteink során azt találtuk tehát, hogy a pepsztatintermelő törzsek zsírsav-részként kapronsavat tartalmazó pepsztatint, pepsztatin B-t is képesek termelni. A megfigyelés alapján várható volt, hogy a részletes vizsgálatok során fermentlé egyéb zsírsav-homológ pepsztatin-származékokat is tartalmaz. A részletesebb vizsgálatok során sikerült is a pepsztatin C elnevezésű anyagot elkülöníteni, amely zsírsavként izokapronsavat tartalmazott, Rf értéke pedig megegyezett a pepsztatin B értékével, azaz a fenti rendszerben 0,39 volt. Egy másik pepsztatin-származék metilészterének Rf -értéke 0,42 volt. Ez az antipepszin-hatású anyag finom tűs kristályokat képez, savas hidrolizátuma a fenti aminosavakat tartalmazza, a gázkromatográfiás elemzés szerint pedig 5 db 5—16 szénatomos zsírsavat tartalmaz. A fentiekben vázolt vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a pepsztatin B-nek nevezett vegyület a n-kaproil-L-valil-L-valil-4(s)-amino-3(s)-hidroxi-6-metilheptanoil-L-alanil-4(s)-amino-3(s)-hidroxi-6-metil-heptánsav, míg a pepsztatin C névvel jelölt vegyület az izokaproil-L-valil-L-valil-4(s)-amino-3(s)-hidroxi-6-metilheptanoil-L-alanil-4(s)-amino-3(s)-hidroxi-6-metil-heptánsav. Az új pepsztatin-származékok előállítására szolgáló találmány szerinti eljárás lényege, hogy asszimilálható szén- és nitrogénforrást, így kazeint, fölözött tejet és/vagy szójaliszt nitrogénforrást tartalmazó tápközeget pepsztatint termelő Streptomyces testaceus ATCC 21469 vagy Streptomyces argenteolus var. toyonakensis ATCC 21468 törzzsel inokulálunk és a szokásos aerob körülmények között inkubálunk 23—27 C° hőmérsékleten 3—10 napon keresztül, a fermentlé maximális anti-pepszin aktivitásának [The Journal of Antibiotics 23, 263 (1970)] kialakulásáig. A hatóanyagot a fermentléből — adott esetben szűrés után — n-butanollal extrakcióval különítjük el. A hatóanyagot a micélium-massza metanolos extrakciójával is elkülöníthetjük. A kapott extrák -tumot a továbbiakban szirupsűrűségig vagy sárga csapadék kiválásáig töményítjük. A szirupot 5—20-szoros mennyiségű vízbe csepegtetjük, majd a kivált csapadékot szűrjük és szárítjuk. A csapadék nyers pepsztatinból áll. A nyers pepsztatint rövidszénláncú alkoholban oldjuk és kismennyiségű észterező katalizátor hozzáadásával észterezzük: több órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk vagy nagyobb hőmérsékleten melegítjük. Észterező katalizátorként sósavat, kénsavat, p-toluolszolfonsavat, tionilkloridot, foszforpentakloridot, foszforoxikloridot stb. alkalmazunk. A metilezés során kapott termék nagyrészt pepsztatin-metilésztert tartalmaz, ez a metanolos oldatból kristályosítással különíthető el. A kristályfrakciót vékonyréteg-kromatográfiával vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a termék 1: 1 arányban tartalmaz pepsztatint és a találmány szerinti új pepsztatin-számazékokat. A szóbanforgó új pepsztatin-származékok nagyrészt az anyalúgban maradnak és onnan betöményítéssel különíthetők el. A kristályfrakciót metanolból kristályosítjuk át, majd az anyalúgot elválasztjuk a kristályoktól. Az anyalúg alig tartalmaz pepsztatin-metilésztert, peptidtartalma főként a találmány szerinti új pepsztatin-származékokból áll. Ezek átkristályosítás után finom tűs kristályos termékként válnak ki az anyalúgból. A találmány tárgya továbbá eljárás az új pepsztatin-származékok alkálisóinak előállítására. A találmány szerinti eljárás lényege az, hogy az új pepsztatin-származékok alkoholokkal képzett észtereit lúgos hidrolízisnek vetjük alá, majd a lúgos hidrolizátumot semlege-5 sítjük. A lúgos hidrolízist a 161558 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint valósítjuk meg. A pepsztatin B nátriumsó amorf fehér por, bomláspontja 250—255 C°, 50%-os pepszin-gátló koncentrációja (ID50 -értéke) 0,055. A pepsztatinnal el-10 lentétben a metanolból kétszer átkristályosított szabad formájú pepsztatin B amorf fehér por, amelynek bomláspontja kb. 210—220 C°, fajlagos forgatása, (oc)g1 = = — 85 C° (c = 1, matanol). A termék infravörös spektrumát a 2. ábrán mutatjuk be. A szóbanforgó termék 15 metanolban könnyen oldódik (oldhatósága 100 mg/ml), azaz tízszer nagyobb, mint a pepsztatiné. A termék vizes butanolban, etanolban, izopropilalkoholban, dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban, ecetsavban vagy piridinben oldható, vizes acetonban gyengén, vízmentes 20 acetonban, vízmentes butanolban, kloroformban, benzolban, éterben és vízben alig oldódik. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban az oltalmi kör korlátozása nélkül példák segítségével ismertetjük. 25 1. példa 5,5 g glükózt, 2,0% szójabab-olajat, 4,5% fölözött tejet, 5,0% kazeint, 0,15% K2 HP0 4 -t, 0,35% NaCl-t, 30 0,15% MgS04 • 7H2 0 4 -t tartalmazó sterilizált tápközeget (pH = 6,45) pepsztatin-termelő Streptomyces testaceus ATCC 21469 törzzsel oltunk be, majd a 2900 liter térfogatú közeget 112 órán keresztül keverés és levegőztetés közben 23—24 C°-on inkubáljuk. A fenti idő után 35 a fermentlé antipepszin-aktivitása 2260 y/ml pepsztatin-koncentrációnak felel meg. A fermentlé pH-ját híg kénsavval 2,5-re állítjuk be, majd 3600 liter metanolt adunk az elegyhez, az elegyet 40 percen keresztül 15—20 C°-on keresztül keverjük, 4% szűrési segédanyagot adunk 40 hozzá, szűrjük és mossuk. A kapott 3600 liter térfogatú metanolos anyalúgot lúggal pH = 10-ig lúgosítjuk, majd a metanolt vákuumdesztillációval eltávolítjuk. A kapott vizes párlási maradék térfogata 1900 liter. A párlási maradékhoz 800 liter n-butanolt adunk, az 45 elegy pH-ját 7,0-re állítjuk be, 30 percen keresztül 20 C°-on keverjük, majd a butanolos extraktumot elkülönítjük (térfogata 960 liter). A butanolos extraktum pH-ját 3,0-ra állítjuk be, majd az extraktumot 55 liter térfogatra pároljuk be. A tömény oldatot keverés köz-50 ben, 60 perc alatt 800 liter vízbe csepegtetjük be, majd a kivált csapadékot szűrjük. A csapadékot vízzel mossuk, végül liofilizáljuk. A liofilizálás után kapott sárga színű por nyers új pepsztatin-származékokat tartalmaz, súlya 7990 g. A por az elegy antipepszin aktivitásának 64%-át 55 tartalmazza. 6080 g fentiek szerint előállított, nyersterméket tartalmazó port 33 liter metanolban oldunk, majd az oldatot 1,25 kg csontszénnel derítjük. A derített oldathoz hozzáadunk 125 ml tömény kénsavat, majd az elegyet 2,5 órán 60 keresztül 60 C°-on keverjük. A reakcióelegyet 0,63 liter trietilamin hozzáadásával semlegesítjük, 2 órán keresztül 50—60 C°-on keverjük, a kapott kristályos fehér port mossuk és vákuumban szárítjuk. A kapott új termék — amely az új pepsztatin-származékok metilész-65 terét tartalmazza — 0,056 y antipepszin aktivitással 2
