166526. lajstromszámú szabadalom • Emberi epiteliális, heterploid májsejtvonal

5 166526 6 nősen borjúsavóval. Az aminosavak és vitaminok szokásos mennyiségét előnyösen kétszeresére növeljük. A 199 jelű tápfolyadék [lásd: Morgan J. F., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1, (1950)] szintén alkalmazható. A generációs idő általában, alkalmas 5 körülmények között, 15 óra körül van, például 37 °C-on. A sejtvonal nem képez összefüggő réteget, hanem szigetekben, vagy izolált halmazokban növekszik, így a máj lebenykéihez hasonlít. E halmazoknak átmérője 2—3 mm közötti, vagy-3 mm körű- 10 li érték. Biokémiai szempontból jellemző, hogy a találmány szerinti sejtvonalak glikogént termelnek, hasonlóan a máj funkcionális hepatocitáihoz. Mint minden humán, folyamatos, heteroploid sejtvonal, ezek is da- 15 ganatképzők, például a hörcsög pofazacskójába oltva. A megnövekedett glikogén-termelést a glükózkoncentráció függvényében a következő kísérlet igazolja : 20 A glikogén-tartalmú sejteket vizes alkáliákban forraljuk, a proteinek hidrolízise céljából. A glikogént azután alkohol hozzáadásával leválasztjuk és savas hidrolízissel teljes mértékben átalakítjuk D-glükózzá. A glükóz mennyiségét azután kvantitatíve 25 meghatározzuk, és ebből kiszámítjuk az eredeti glikogén-tartalmat. A kvantitatív glükóz-meghatározást úgy végezzük, hogy rézszulfát-tartalmú reagenst (ún. „Somogyi reagenst") adunk az oldathoz. A le-nem-reagált réz- 30 szulfátot 0,005 n nátriumtioszulfát-oldattal titráljuk, amikor is a rézoxid-csapadék megjelenése jelzi a végpontot. 1 mg tiszta kristályos inzulint (biológiai aktivitása 22,3 I. E.) 5 ml vízben szuszpendálunk. A szusz- 35 penzió 1 csepp 1 n sósav-oldat hozzáadására azonnal oldattá alakul. A kapott oldatot 200 ml, 1% glükózt tartalmazó közeghez adjuk. 1/1' — inzulin; 2/1-— kontroll inzulin nélkül, de 1% glükózzal üres kontroll (blank) 10,00; 1/1 — nedves súly 0,39 g; fogyasztás 5,15 ml; glikogén-tartalom 3,32 mg/g; 2/1. — nedves súly 0,19 g; fogyasztás 4,80 ml; glikogén-tartalom 6,35 mg/g; Emberi embrió-máj epiteliális sejtjeiben a glikogén kimutatását a következőképpen Végezzük: Körülbelül 1 g nedves súlyú sejtet feloldunk 5 ml 35%-os káliumhidroxid-oldatban, és az oldatot éjszakán át állni hagyjuk. Hozzáadunk 20 ml etanolt, keverés közben. Fehér csapadék válik ki. Dékantálunk és az anyagot szárítjuk. 70 °C-ra hevítve, 30 Hgmm nyomáson ledesztilláljuk az etanolt. Ezután hozzáadunk 1 ml n sósav-oldatot és 3 órán keresztül melegítjük a reakcióoldatot 90 °C-on> ledugaszolt lombikban. Ezután hűtünk, 1 n nátriumhidroxid-oldattal semlegesítünk és hozzáadunk 5 ml ún. „Somogyf-reagenst. A reakcióoldatot 20 mp-ig forró vízben tartjuk, lehűtjük és hozzáadunk 1 ml 2 n kénsav-oldatot. 0,005 n nátriumtioszulfát-oldattal titrálunk: 40 45 50 55 60 65 17,50 ml 11,25. ml 6,25 ml nátriumtioszulfát-oldat Üres kontroll: 30,05 ml 17,50 ml 12,55 ml nátriumtioszulfát-oldat Fogyasztás = 6,30 ml. 1 mg glükózzal végezve a kísérletet hasonló módon, a fogyasztás = 5,10 ml nátriumtíoszulfát-oldat. Így a glikogén-tartalom = 1,24 mg glükóz. Kontroll: HeLa sejtekkel végezve a kísérletet hasonló módon, a fogyasztás = 1,30 ml nátriumtioszulfát-oldat, ugyanakkor rézoxid-képződés nem látható. Egyéb sejtvonalaknál a megnövekedett glikogéntermelést a glükóz-koncentráció függvényében a következő kísérlet mutatja be: A módszer azonos a fent leírtakkal. Üres kontroll: 13,3 ml 12,1 ml 12,95 ml HeLa — nedves súly 0,500 g fogyasztás 1,95 ml rézoxid-képződés nem látható látszólagos glikogén-tartalom 0,72 mg/g Hep-2 — nedves súly 0,459 g fogyasztás 2,20 ml rézdioxid-képződés nem látható látszólagos glikogén-tartalom 0,89 mg/g RK-13 nedves súly fogyasztás 0,197 g 2,00 ml rézoxid-képződés nem látható látszólagos glikogén-tártalom 1,88 mg/g Emberi amnion — nedves súly 0,204 g , fogyasztás 0 glikogén-tartalom 0 Mint kísérleteinkből látható, 1%-nyi glükóz jelenléte megnövelte a sejtek (lásd az inzulin-kísérletet) glikogén-tartalmát 3,32 mg/g-ról 6,35 mg/g-ra. Ez bizonyítja, hogy körülbelül 1% glükóz adagolása legalább 50%-kal megnöveli a sejt-rendszer glikogén-tartalmát. Nyilvánvaló, hogy ez az érték függ a reakciókörülményektől, de a körülbelül 1%-nyi glükóz-menynyiség tipikus adalékanyaga az általánosan alkalmazott tápközegnek. Ilyen glükóz-mennyiség esetén jellemző a találmány szerinti máj sejtvonalra, hogy leg* 3