166448. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polinukleotidfoszforiláz előállítására
5 166448 6 juk. A felső réteg, amelynek térfogata 17,6 ml, az alábbi jellemzőkkel rendelkezik: protein-tartalom 2,8 mg/ml, PNFáz-aktivitás körülbelül 0,273 egység/ml, 0,094 PNFáz egység/mg protein. A felső réteg összes PNFáztartalma megközelítőleg 4,8 egység, amely a homogenizált sejtszuszpenzió centrifugálásával nyert felső réteg PNFáz aktivitásának 20%-os visszanyerését jelenti. 2. példa Az 1. példa szerint előállított hideg sejt-pépet jéghideg 0,5%-os nátriumklorid-oldatban újra szuszpendáljuk, így olyan M. luteus sejt-szuszpenziót kapunk, amely körülbelül 100 g száraz sejtet tartalmaz 1 liter 0,5%-os nátriumklorid-oldatra számítva. Ennek a szuszpenziónak a pH-ját 8-ra állítjuk be és lizozimmal kezeljük körülbelül 12 percen keresztül 37 C° hőmérsékleten 3,5 X 108 egység/liter sejt-szuszpenzió mennyiségben. Az oldatot gyorsan lehűtjük, összekeverjük fele térfogat mennyiségű hideg telített ammóniumszulfátoldattal és centrifugáljuk. A felső réteget körülbelül 15 órán keresztül dializáljuk PNFáz-pufferral szemben. A visszamaradó anyagot 0,66 térfogatrész etanollal kezeljük, amelyet előzőleg —20 Cc alá hűtöttünk. A vizes etanolos oldatot körülbelül 5 C° alatti hőmérsékleten, körülbelül 15 órán keresztül állni hagyjuk, a lecsapódott anyagot centrifugálással kinyerjük, 100 ml PNFáz-pufferban szuszpendáljuk és friss PNFázpufferral szemben dializáljuk. A visszamaradó anyagot centrifugálással tisztítjuk. így olyan oldatot kapunk, amely körülbelül 100 PNFáz egység/100 g M. luteus sejt kiindulási anyagot tartalmaz (száraz súly egyenérték). Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás polinukleotidfoszforiláz előállítására, azzal jellemezve, hogy az American Type Culture Collectionban ATCC 4698 sz. alatt deponált Micrococcus lysodeikticus törzs fermentációs táptalajából leszűrt sejtpépet vizes, előnyösen 0,5%-os konyhasó oldatban szuszpendáljuk és a keletkező szuszpenziót homogenizáljuk vagy elroncsoljuk, így felszakítjuk a sejteket és oldhatatlan sejthulladék szuszpenziót állítunk elő vizes 5 polinukleotidfoszforiláz-oldatban, ezután az elegyhez 24% koncentrációig ammóniumszulfátot adunk és a sejthulladékot, valamint a proteineket centrifugálással elválasztjuk az elegytől, a felső rétegként kapott vizes polinukleotidfoszforiláz-oldathoz rövidszénláncú alka-10 nolt adva a polinukleotidfoszforiláz teljes mennyiségét lecsapjuk, majd a vizes alkanolos elegyből centrifugálással elválasztjuk a lecsapódott polinukleotidfoszforilázt. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy rövidszénláncú alkanolként 15 metanolt alkalmazunk, a vizes polinukleotidfoszforilázoldat térfogata 30—80%-ának megfelelő mennyiségben. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy rövidszénláncú alkanolként izopropanolt alkalmazunk, a polinukleotidfoszforiláz-20 oldat térfogata 30—40%-ának megfelelő mennyiségben. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy rövidszénláncú alkanolként etanolt alkalmazunk, a polinukleotidfoszforiláz-oldat térfogata 35—45%-ának megfelelő mennyiségben. 25 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az ammóniumszulfát adagolás és centrifugálás után a felső réteget polinukleotidfoszforiláz-pufferral szemben dializáljuk, és a maradékként keletkező polinukleotidfoszforiláz-oldatot 40 tér-30 fogat% etanollal felhígítjuk. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja a polinukleotidfoszforiláz elkülönítésére a vizes oldatból, azzal jellemezve, hogy az oldathoz az oldat térfogatának 30—80%-ával egyenlő térfogatú rövidszén-35 láncú alkanolt adunk. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy rövidszénláncú alkanolként etanolt alkalmazunk a vizes polinukleotidfoszforilázoldat térfogatának 35—45%-nyi mennyiségében. 40 8. A 6. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy rövidszénláncú alkanolként etanolt alkalmazunk, a polinukleotidfoszforiláz-oldat térfogata 40%-ának megfelelő mennyiségben. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 76.2766.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató
