166448. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polinukleotidfoszforiláz előállítására
MAGYAR N ÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEI RAS Bejelentés napja: 1971. V. 04. Amerikai Egyesült Államok-beli elsőbbsége: 1970. X. 01. (77334) Közzététel napja: 1974. X. 28. (ME—1357) Megjelent: 1976. V. 31. 166448 Nemzetközi osztályozás: C 12 d 13/10 C 07 g 7/028 Feltalálók: Hoffmann Carl Herman vegyész, Scotch Plains, N. J. Rothrock John William vegyész, Watchung, N. J. Michelson Stuart Roy vegyész, Englishtown, N. J. Amerikai Egyesült Államok Tulajdonos: Merck et Co., Inc. Rahway, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok Eljárás polinukleotidfoszforiláz előállítására i A találmány tárgya új eljárás polinukleotidfoszforiláz (PNFáz) előállítására. Közelebbről a találmány tárgya javított eljárás a polinukleotidfoszforiláz vizes oldatból történő elkülönítésére, amely eljárást az jellemez, hogy az oldathoz vízzel elegyedő szerves oldószert adunk, 5 amely gyakorlatilag nem oldja a polinukleotidfoszforilázt, így ez kicsapódik és szilárd alakban kapjuk, ezután puffer oldatban újra feloldjuk és dialízisnek vetjük alá, így elkülönítjük a nem kívánt szervetlen só szennyezéseket. 10 Eddig a polinukleotidokat oly módon állították elő, hogy vizes oldatban valamely nukleoziddifoszfátot vagy nukleoziddifoszfátok elegyét és valamely nukleozidpolimerizáló enzimet, így polinukleotidfoszforilázt, RNA-polimerázt és hasonlókat érintkezésbe hoztak 15 egymással (C. A. 65, 10 879 c, 65, 10 870 a). Amikor a polimerizáció elérte a kívánt mértéket az enzim katalizátort általában elbontották, majd a polinukleotid terméket szükségszerűen elválasztották az inaktivált enzimtől. Ezért ezeknek a polimerizációs módszereknek 20 az esetén a katalizátor még akkor is kárbaveszett a tisztítás során, ha a reakció során az enzim katalizátor nem használódott fel, így a nukleoziddifoszfát minden új adagjának polimerizálásáhöz friss katalizátorra volt szükség. Ezen túlmenően a polinukleotid tisztítása na- 25 gyón bonyolult volt, mert nehézségekbe ütközött a polinukleotid és az inaktivált enzim protein elválasztása. A J. Biol. Chem. 243, 923—927. (1968) irodalmi helyen ismertetett eljárással olyan polinukleotidfoszforilázt állítanak elő, amelynek tisztasága 95%. A Proc. Nucl. 30 Acid Res. (1966) 245—262. irodalmi, helyen szereplő eljárás értelmében polinukleotidfoszforilázt tisztítanak oly módon, hogy az elroncsolt sejt-keveréket extrahálják, az enzimet ammoniumszulfattal lecsapják, dializálják, ammoniumszulfattal újra lecsapják és ioncserélővel kezelik. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy vizes táptalajban Micrococcus lysodeikticus-t (ezt M. luteusnak nevezzük) fermentálunk, így vizes PNFáz-oldatot nyerünk, a PNFáz enzimet tartalmazó sejtpépet elkülönítjük, homogenizálással felszakítjuk a sejteket, majd a felülúszó vizes PNFáz-oldatból elkülönítjük az enzimet. Eljárhatunk úgy is, hogy a sejteket elroncsoljuk, előnyösen úgy, hogy vizes közegben lizozimmal hozzuk őket érintkezésbe körülbelül 100 g/l sejtkoncentrációt és körülbelül 3,5 X 106 egység/liter lizozim koncentrációt alkalmazva. A vizes PNFáz-oldatot (a homogenizált sejtek centrifugálásakor kapott felső réteg alakjában vagy elroncsolt alakban) megfelelően tároljuk, szükség esetén fagyasztott állapotban. Ehhez a vizes PNFáz-oldathoz, amelyet, ha fagyasztott állapotban tároltunk, az elkülönült protein anyag eltávolítása céljából centrifugálunk, megfelelő mennyiségű ammóniumszulfátot adunk, hogy az oldat ammóniumszulfát koncentrációját körülbelül 24%-ra vigyük, így a protein anyagot (valamint a sejthulladékot, ha a sejtek elroncsolódtak) lecsapjuk. A keletkező felülúszó PNFáz-oldatot, amelyet kívánt esetben dialízisnek vethetünk alá (hogy eltávolítsuk az ammóniumszulfátot), ezt követően felhígítjuk valamely vízzel elegyedő szer-166448 1
