166408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a nigericin alkálsójának előállítására

3 166408 4 giai úton kapott tenyészetet semleges vagy savas pH-n szűrjük, az így kapott micéliumot vizes metanollal extraháljuk, az extraktumot szűrjük, betöményítjük, majd feldolgozzuk oly módon, hogy az első szűrés után kapott micélium vizes metanolos extrakcióját lúg jelenlétében 5 végezzük, és a sűrítményt úgy dolgozzuk fel, hogy vízzel hígítjuk, és a hígítás hatására kivált nigericin-alkálisót elkülönítjük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint az extrakcióhoz 1—3% nátrium- vagy 10 kálium-hidroxidot tartalmazó vizes metanolt használunk, továbbá a sűrítményt 1—5-szörös mennyiségű vízzel hígítjuk. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a nigericint termelő mikroorganizmus-tenyésze- 15 tet megfelelő antibiotikumszint elérése után semleges vagy savas, célszerűen pH 3-as közegben szűrjük. A szüredéket, mely gyakorlatilag nem tartalmaz hatóanyagot, elöntjük. A hatóanyagtartalmú micéliumot nátrium- vagy káli- 20 umhidroxidot tartalmazó vizes metanollal extraháljuk. A micéliumot ismét leszűrjük, és a lúgos extraktumot vákuumban 60 C° alatt betöményítjük. A sűrítményt vízzel felhígítjuk; ekkor kiválik a nigericin alkálisója, amelyet lecentrifugálunk. Az így kapott nyerstermék 25 kielégítő minőség esetén végterméknek tekinthető, ellenkező esetben vizes metanolból kevés veszteséggel átkristályosítható. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy lehetővé teszi a nigericinnek az ismert módszerekhez viszonyítva 30 egyszerűbb, jóval kevesebb lépésben és veszélytelenebb műveletekkel kivitelezhető, gazdaságos üzemi szintű izolálását alkálisója formájában. Eljárásunkkal 2—3 g/l hatóanyag tartalmú fermentléből a hatóanyag 45—55%a nyerhető ki, ami a fermentációs iparban igen jó 35 eredménynek számít. A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy kevés számú műveleti lépésben, egyszerű módon 950—1000 E/mg biológiai aktivitású nigericin-alkálisó izolálását teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi 40 kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa 45 Streptomyces albus (MNG 105) tenyészetéből nyert 80 kg présnedves micéliumot, amely összesen kb. 1600— 1650 g hatóanyagot tartalmaz, háromszoros térfogatú vizes nátriumhidroxidot tartalmazó metanollal (240 liter metanol, mely 4,8 liter 40%-os vizes nátriumhidro- 50 xidot tartalmaz) extrahálunk két órán át, a micéliumot műanyag szűrővásznon leszűrjük, majd újra extraháljuk kétszeres térfogatú, vizes nátriumhidroxidot tartalmazó metanollal (80 liter metanol, mely 800 ml 40%-os vizes nátriumhidroxidot tartalmaz). Végül szűrés után a micé- 55 liumot egyszeres térfogatú, 40 liter tiszta metanollal keverve kimossuk. A metanolos extraktumot és mosó A kiadásért felel: á Közgazdasági és metanolt egyesítve vákuumban 60 C° hőmérsékleten besűrítjük annyira, amennyire a habzás megengedi, majd a meleg sűrítményt keverés mellett kétszeres térfogatú kb. 100 liter desztillált vízhez adjuk. Az állás közben kivált nigericin-Na sót ülepítő centrifugával elválasztjuk az anyalúgtól. A centrifugáról leszedett csapadékot vízzel többször jól elkeverve, nuccson szűrjük és vízzel semlegesre mossuk. A termék nedves súlya: 2,50 kg, száraz súlya: 790—800 g (48—50%); olvadáspontja: 259— 260 C°. A nedves terméket — ha a színe szükségessé teszi — átkristályosítjuk. A nedves nigericin-Na sót 7,50 liter 96%-os etanolban vagy metanolban 50 C° és 60 C° közötti hőmérsékleten feloldjuk, majd 5%, azaz 12,5 g aktív szénnel derítjük. 15—20 percnyi keverés után Seitzlapon szűrjük, majd a még meleg szűrlethez 7,5 liter 60 C°-os vizet adagolunk keverés közben, amíg a zavarosodás állandó nem marad. Rövid idő múlva megindul a kristályosodás. Az esetleg megmaradt vizet ezután hozzákeverjük a kristálykásához. Miután a szuszpenzió lehűlt, vízzel jól kimossuk és szárítjuk. Az így kapott tiszta termék súlya 730—760 g (45—46%), mely mindenben megfelel az irodalomban leírt adatoknak [J. Antibiot. 21, 402 (1968)]: olvadáspontja 259—262 C°; biológiai aktivitása 1000 E/mg. A biológiai aktivitást a szokásos módon agardiffúziós módszerrel határoztuk meg, tesztorganizmusként Bacillus subtilist (ATCC 6633) használtunk. 2. példa Mindenben az 1. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy nátriumhidroxid helyett káliumhidroxidot használunk. Kitermelés: 760—770 g (45—47%); biológiai aktivitás 990 E/mg; olvadáspont 260 C°. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás mikrobiológiai úton nyert nigericin alkálisójának előállítására, ahol a Streptomyces albus tenyészetet semleges vagy savas pH-n szűrjük, és az így kapott micéliumot vizes metanollal extraháljuk, az extraktumot szűrjük, betöményítjük, majd feldolgozzuk, azzal jellemezve, hogy a micélium vizes metanolos extrakcióját lúg jelenlétében végezzük, és a sűrítményt úgy dolgozzuk fel, hogy vízzel hígítjuk, és a hígítás hatására kivált nigericin-alkálisót elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az extrakcióhoz 1—3% nátrium- vagy káliumhidroxidot tartalmazó vizes metanolt használunk. 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a sűrítményt 1—5-szörös mennyiségű vízzel hígítjuk. ;i Könyvkiadó igazgatója 2 76.2762.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató