166346. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rapamicin előállítására

3 166346 4 pamicint ennek megfelelően a legkülönfélébb területeken alkalmazhatjuk a gombák növekedésének megakadályozására, vagy a kifejlődött gombák számának csökkentésére. A találmány szerinti eljárásban rapamicin-termelő mikroorganizmusként Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 törzset alkalmazunk. Ezt a mikroorganizmus-törzset húsvét-szigeti talajmintákból különítettük el, és a Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U. S. Department of Agriculture (Peoria, Illinois, Amerikai Egyesült Államok) intézetben helyeztük letétbe. Hangsúlyozzuk, hogy a találmány szerinti eljárásban az említett mikroorganizmus-törzs helyett annak természetes kiválasztás vagy mutagen kezelés hatására (például ultraibolya vagy röntgen-sugárzás, N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidin, mangánklorid, kámfor, nitrogénmustárok vagy hasonló mutagen szerek hatására) kialakult mutánsait és variánsait, valamint a különféle mutánsok és variánsok poliploidjait is felhasználhatjuk. A Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 törzs erőteljesen fejlődik az azonos nemzetségbe tartozó egyéb mikroorganizmus-törzsek tenyésztésére általánosan felhasznált táptalajokon. E mikroorganizmus Czapekagaron, glükóz-aszparagin-agaron, glicerin-aszparagin-agaron, keményítő-agáron és pepton-húsleves-agaron 20—35 C°-on, előnyösen 28 C°-on tenyészthető. E mikroorganizmus élesztőkivonat-agaron, malátakivonat-agáron, keményítő-szervetlen só-agaron, zabliszt-agáron, zabliszt-paradicsom-agaron és Bennet-agaron is igen jól tenyészthető. A burgonyaszeleteken tenyésztett mikroorganizmus nem fejleszt légmicéliumokat, e szubsztrátumon azonban bőséges, barnássárga színű növekedés észlelhető. Minden táptalajon kezdetben fehér, majd fekete foltokat tartalmazó szürkés felszíni mikroorganizmus-részek fejlődnek. A sporofórák gyakran tömörek, és több, mint tíz spórából álló spirálokat képeznek. A szubsztrátumon fejlődő mikroorganizmusrészek színe halványsárgától csaknem színtelenig változik, néhány táptalajon halványbarna. A mikroorganizmus esetenként sárgás pigmentet termel. A mikroorganizmus negatív kénhidrogén- és melanin-reakciót ad. A Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 törzs szénhidrát-hasznosítását az International Streptomyces Project (ISP) szabványosított eljárásával vizsgáltuk, szénforrást tartalmazó agáron (9 sz. ISP-közeg). E vizsgálat szerint a mikroorganizmus-törzs legjobban a D-glükózt, inozitot, D-fruktózt és D-mennitot hasznosítja, míg a ramnózt, raffinózt, xilózt, keményítőt és arabinózt csak kisebb mértékben használja fel. A mikroorganizmus a szacharózt és a cellulózt nem hasznosítja. A Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 törzs tenyésztéséhez szükséges tápanyag- és környezeti feltételek hasonlóak az egyéb aerob mikroorganizmusok antibiotikum-termelésének kiváltásához szükséges feltételekhez. A mikroorganizmus aerobiózisát például úgy tarthatjuk fenn, hogy a steril tenyészettel beoltott folyékony táptalajt lombikokba töltve, rázás közben inkubáljuk. Ipari méretekben a mikroorganizmust belső levegőbevezetéssel és keverőlapátokkal felszerelt fém-fermentorokban tenyészthetjük. A mikroorganizmus felületi tenyésztés esetén is termel rapamicint. A mikroorganizmus tápanyagként asszimilálható szénforrást és szerves nitrogéntartalmú vegyületeket igényel. A fermentációt előnyösen ásványi sók jelenlétében végezzük. A tenyésztést előnyösen 5,8 és 7,5 közötti pH-értékű táptalajon végezzük. Az antibiotikum-termelés szempontjából hasznosít-5 ható asszimilálható szénforrások igen sokfélék lehetnek. E szénforrások közül példaként a cukrokat (így a glükózt, D-fruktózt, D-mannitot, maltózt, arabinózt, ramnózt, raffinózt, xilózt és hasonló vegyületeket), a dextrint, a különböző eredetű keményítőféleségeket, a glicerint 10 és a hasonló polialkoholokat, az inozitot, valamint a növényi és állati zsírokat és azok észtereit említjük meg. A növekedést serkentő és a rapamicin-termelést elősegítő asszimilálható nitrogéntartalmú szerves anyagok például a következők lehetnek: szójababliszt, gyapot-15 liszt, egyéb teljesen vagy részlegesen zsírtalanított növényi lisztek, húsliszt, állati zsigerek, különféle peptonok, kazein-hidrolizátumok, szójabab-hidrolizátumok, élesztő-hidrolizátumok, laktalbumin, búzasikér, oldható cefre, kukoricalekvár, melasz, karbamid és aminosavak. 20 A táptalajhoz megfelelő mennyiségben ásványi sókat, például nátrium-, kálium-, ammónium- és kalcium-kloridot, -nitrátot, -szulfátot, -karbonátot és -foszfátot adhatunk. A tenyésztést nyomelemeket, így magnéziumot, vasat, mangánt és cinket tartalmazó táptalajon 25 végezzük. A fermentációs közeget a Streptomyces hygroscopicus-törzs friss ferde tenyészetével oltjuk be. Ha a tenyésztést a fenti körülmények között körülbelül 20—35 C°-on, előnyösen körülbelül 25 C°-on végez-30 zük, a maximális rapamicin-termelést (tanktenyésztés esetén) körülbelül 2—8 nap elteltével érjük el. A rapamicin elkülönítését és tisztítását különféle módszerekkel, például oldószeres extrakcióval, megosztásos kromatográfiával, szilikagél-kromatográfiával, Craig-35 készülékben végzett, két folyadékfázis közötti megosztással, vagy oldószeres kristályosítással végezhetjük. Ipari méretekben előnyösen az oldószeres extrakciót alkalmazzuk, ez a művelet ugyanis kevésbé időigényes és kevésbé költséges az egyéb módszereknél. 40 A rapamicint például az alábbi módszerek valamelyikével különíthetjük el: (a) A fermentlevet vízzel nem elegyedő oldószerrel, például közepes szénláncú alkanollal (így n-butanollal, n-pentanollal, „Pentasol" kereskedelmi nevű izomer 45 pentanol- eleggyel vagy n-hexanollal), rövidszénláncú alkánkarbonsav-rövidszénláncú alkilészterrel (például etilacetáttal, butilacetáttal, amilacetáttal vagy kereskedelemben kapható izomer amilacetát-eleggyel), vagy halogénezett alifás szénhidrogénnel (így kloroformmal, 50 metilendikloriddal vagy diklóretánnal) extraháljuk. Az extraktumot szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk. Az így kapott olajos maradékot ezután vízzel elegyedő oldószerrel, előnyösen rövidszénláncú alkanollal, például metanollal vagy etanollal extraháljuk. Az így 55 kapott extraktumot diatómaföldön (például Celite-n) szűrjük, és a szürletet csökkentett nyomáson bepároljuk. Nyers rapamicint tartalmazó, olajos maradékot kapunk(b) A fermentlevet diatómaföldön (például Cetile-n) szűrjük, majd a micéliumot tartalmazó szűrőlepényt 60 a (c) módszernél ismertetésre kerülő módon extraháljuk. A szűrletet, azaz a micélium-mentes fermentlevet vízzel nem elegyedő oldószerrel többször extraháljuk. Vízzel nem elegyedő oldószerként például az (a) módszernél felsorolt közepes szénláncú alkanolokat, rövidszénláncú 65 alkánkarbonsav-rövidszénláncú alkilésztereket vagy ha-2