166074. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozóhoz kötött biológiailag aktív proteinek előállítására
166074 7 8 nosítást értünk el és a kapott terméket katalizátorként több, mint egy félévig használtuk állandóan anélkül, hogy aktivitása lényegesen csökkent volna. A találmány szerinti eljárás különösen előnyös foganatosítása módjának alkalmazásánál olefinesen telítetlen 'monomerek, így különösen az akrilsav és metakrilsav származékok jelenlétében végzett polimerizálásnál, továbbá előny a mikroorganizmus-fertőzéssel szembeni stabilitás, a jól kézbentartható duzzadása körülmények (fontos, ha oszlop tölteteként kívánják alkalmazni), valamint a kívánt töltés, illetve töltésmentesség könnyű beállíthatósága. A találmány szerinti eljárás még további előnye, hogy rendkívül egyszerűen kivitelezhető. A következő példák kapcsán részletesebben ismertetjük a találmányt. 1. példa: Kiindulási anyagok: 0,1 g glükóz-oxidáz (GOD), 220 egység/mg, akrilamid, akrilsav-(2,3-epoxipropilészte!r), N,N'-metilén-bisz-akriilamid, 3-dimetilaimino-propionitril, arnmóniumperoxidiszulfát. Módszer: 0,1 g GOD^t feloldunk 2 ml, 8 pH-értékű, 0,5 módos trietanaianiin-pufferbeii, nitrogénatmoszférában, 30 C°-j on 0,25 ml akrilsav j (2,3--epoxipropilészter)-rel elegyítjük és 30 percen át keverjük. Ezt követően +10 C°-ra hűtjük le, majd összekeverjük 18 ml desztillált vízben oldott 3 g akrüaimiddal és 0,1 g N,N'^metilén-bisz-^afcrilamiddal. Nitrogénatmoszférában mintegy 15 perc múlva indítjuk meg a polimerizációt, 0,5 ml 5%-os 3-dimetilaminopropionitril és 3 ml 5%-os arnmóniumperoxidiszulfát: hozzáadásával. Az oldat mintegy 5 perc múlva viszkózussá válik, majd sárga átlátszó, merev géllé polimerizálódik. A polimerizációs blokkot mintegy 18 órán át hűtőszekrényben állni hagyjuk. Ezután a polimerizátumot 0,5 mm átmérőjű fémszitán átnyomjuk és fob. 2000 ml desztillált vízzel mossuk. A gél-részecskéket 2 cm belső átmérőjű oszlopba töltjük és 7,5 pH-értékű 0,2 mólos káliumfoszfát-pufferrel kimossuk az adszorptívan kötött GOD-t, míg az eluátumban további aktivitás már nem mutatható ki. Az eluátumban az eredeti enzim-aktivitás 10 %-át mutattuk ki. A hordozóhoz kötött enzim enzitmatikus aktivitása liofilizátumként 500 egység/g. 2. (összehasonlító) példa: Az 1. példában ismertetett eljárást megismételtük, de a találmány szerinti eljárástól eltérően, nem használtunk epoxivegyületet. 3,0 g akrilamidot és 0,1 g N,N'-metilén-bisz-Jakrilamidot 18 ml desztillált vízben oldunk, majd az oldatot keverés és hűtés közben 2 ml 0,05 mólos, 8,0 pH-értékű trietanolamin-puffer-5 ben oldott 0,1 g GOD-val elegyítjük. Ezután az 1. példában ismertetettekkel azonos módon, nitrogénatmoszférában hozzáadjuk az iniciátoroldatot és a kapott terméket az 1. példa szerint feldolgozzuk. 10 Az eluátumban az eredeti enzicm-aktivitás mintegy 40%-át találtuk kötetlen formában. A kapott termék liofilizálása után a liofilizátum aktivitása 90—100 egység/g. 15 3, példa: Kiindulási anyagok: 20 GOD—I, aktivitása 220 egység/mg, akrilamid, akrilsav-(2,3~epoxipropilészter), N,N'-metilén-bisz-akrilamid, 3-dimetilamino-propionitril, 25 ammóniumperoxidiszulfát. Módszer: 0,15 g GOD-t 1,5 ml desztillált vízben és 1,5 30 ml, 1,0 mólos 8,0 pH-értékű trietanolamin-pufferben, nitrogénatmoszférában +10 C°-ra hűtünk le. Ezt az oldatot összekeverjük 14 ml vízben oldott 3,0 g alkrilamiddal és 0,1 g N,N'^metilén-bisz-akrilamiddal. 35 0,25 ml akrilsav-(2,3^epoxipropilészter) hozzáadása 'mellett 0,5 ml 5%-°s 3-dimetilamino-propionitril és 0,2 ml 5%^os aonmóniumperoxidiszulfáttal megindítjuk a reakciót; a polimerizáció időtartama mintegy 10 perc. 40 A blokkpoliniarizátumot, iaz előzőekben ismertetett módon, fémszitán átnyomjuk és megfelelő módon feldolgozzuk. Az eluátumban végzett aktivitási vizsgálat szerint a protein 100%-ban kovalensen kötődött. 45 A liofilizált termék aktivitása 140 egység/g. 4. példa: Kiindulási anyagok: 50 GOD—I, 220 egység/mg, akrilamid, l-(alliloxi)-2,3-epoxipropán, N,N'-imetilén->bisz-.akrilamid, 55 3-dimetilamino^propionitril, arnmóniumperoxidiszulfát. Módszer: 60 50 mg GOD-t 0,5 ml desztillált vízben és 0,5 ml 1 mólos trietamollaimin-puff erben (pH = 8,0) oldunk, 30 C°-on, nitrogénatmoszférában, majd 0,1 ml l-(alliloxi)-2,3-epoxipropánnal inkubáljuk 40 percen át. Ezután 10 C°-ra lehűtjük és 65 20 ml kétszer desztillált vízben oldott 3 g akril-4
