165957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav előállítására fermentációval
9 165957 10 timális eredmények elérésére azonban a fermentálást előnyösen 26-30 C° közötti hőmérséklettartományban végezzük. A Streptomyces szaporodásához és az antibiotikum termeléséhez megfelelő tápközeg pH-értéke 5-9 között változtatható. 5 Előnyös pH-tartomány azonban 6,0 és 7,5 között van. A találmány szerint úgy járunk el, hogy a 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsavat termelő 10 mikroorganizmus ferdeagar tenyészetéhez steril táptalajt adunk, mely módon sejtszuszpenziót készítünk. A ferde-tenyészet szaporulatát ezután az oltólombik beoltására használjuk, és a jó szaporulat elérésére az oltólombikot 1-3 napig 15 28 C°-on rázzuk. Ezt az oltólombikot használjuk ezután a termelő lombikok beoltására. Változatként az oltólombikot beolthatjuk liofilizált tenyészettel vagy fagyasztott oltóanyaggal is. 20 A beoltást általában 40 ml termelő közegre számítva kb. 1 ml oltóanyaggal végezzük. Az adalékanyagot a szükséges koncentrációban ezután bevisszük - a megkívánt várakozási idő elteltével - a termelő lombikba és a fermentálást 2-4 25 napig végezzük a tápközeg keverése és/vagy levegőztetése közben, mialatt a hőmérsékletet 28 C° körüli értéken tartjuk. Ezen idő elteltével - általában 96 óra után - az összes lombikot: az adalékot tartalmazókat és a kontrollként hasz- 30 náltakat egyaránt, megvizsgáljuk annak megállapítására, hogy az egyes lombikokban mennyi antibiotikum termelődött. A 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karba- 35 moiloximetfl)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav antibiotikumot megfelelően korongvizsgálatnak vetjük alá, 9,5 mm átmérőjű korongokon, vizsgálati mikroorganizmusként Vibrio percolans ATCC 8461 szolgál. Az antibiotikum aktivitását mikrogramm 40 per milliliter szabad savban fejezzük ki. Az antibiotikum ismert koncentrációjú oldataiból szabvány-görbét szerkesztünk. A termelő lombikot ezután megvizsgáljuk oly 45 módon, hogy a mintát 0,02 moláris foszfátpufferben pH 7 értéken megfelelő koncentrációig oldjuk. A vizsgálati mikroorganizmusként Vibrio percolans ATCC 8461-et használunk és vizsgálati közegként Difco-tápagar és 0,2% Difco élesztő- 50 extraktum szolgál. A vizsgálati korongokat 5 mg/ml szabványos antibiotikum oldatba merítjük, és a mintának megfelelően helyezzük a lemezre. A lemezeket ezután 37 C8 hőmérsékleten 18 óra hosszat in- 5S kubaijuk, és a zónaátmérőket milliméterben kifejezve meghatározzuk, öt szabványos lemezt alkalmazunk 2,5 Mg/ml közötti négyféle szabványszinttel. A vizsgálatot monogrammal számítjuk és az eredményeket mikrogram/szabad sav milliliter- 60 ben fejezzük ki. Az antibiotikum a fermentáló közegből számos módszerrel kinyerhető. A szűrt lé átbocsátható egy vagy több ioncserélő oszlopon. Az I. képletű 65 antibiotikum amfoter természete lehetővé teszi az optimális kinyerés elérésére mind a kation, mind az anioncserélő gyanták használatát. Az adszorbeált antibiotikum ezután a gyantából előnyösen illó oldószerben, például piridinben való mosással eluálható. A piridin könnyen elkülöníthető Az alábbi példák a találmány tárgyát szemléltetik, de annak hatóterületét nem korlátozzák. 1. példa Streptomyces lactamdurans NRRL 3802. jelű ferdetenyészetéhez 10 ml steril fölözött tejet adunk. A steril csövek 0,1-0,2 ml fölözött tej szuszpenziót tartalmaznak, melyeket egyenként liofilizálunk, és a fagyasztással szárított tenyészetet használjuk 250 ml-es ledugaszolható Erlenmeyer-lombik tartalmának oltására. A lombik 40 ml oltóközeget tartalmaz desztillált vízben, eredeti élesztő 1%-os mennyiségével. Az oltólombikot 28 C° hőmérsékleten két napig inkubáljuk 220 ford./perc sebességű, 5 cm kitérésű forgó rázógépen. A második oltási szakaszhoz a fenti tenyészetből 1,0 ml-t adunk az ugyanolyan összetételű szintetikus közegben, mint amilyen a szintetikus termelő közeg, és a fentiek szerint két napig inkubáljuk. Mind a 8, egyenként 250 ml-es Erlenmeyer lombikba, melyek a következő összetételű steril közegből 40 ml-t tartalmaznak vízben, pH 7 mellett, 1,0 ml-t adunk az előbbiekben ismertetett második oltóanyagból: Szintetikus termelő közeg Glukóz 1,0% Glutaminsav-mononátriumsó 0,425% Káliumdihi drogénfoszfát 0,2% Ammóniumklorid 0,1% Nátriumklorid 0,05% Magnéziumszulfát-heptahidrát 0,05% Kalciumkarbonát 0,025% i-inozítol 0,02% Vas(II)szulfát-heptahidrát 0,0025% Cinkszulfát-heptahidrát 0,001% Mangán(II)szulfátmonohidrát 0,0005% aminobenzoesav 0,000001% 30 órás inkubálási periódus után vizes oldatot készítünk megfelelő nátriumditionit vagy nátriurritioszulfát tartalommal, 0,1% os végső koncentráció létrehozására. Ezt az oldatot 6 lombikba elosztva beadagoljuk. Az inkubálást még további 66 óra hosszat folytatjuk 28 C8 hőmérsékleten, 220 ford./perc sebességű, 5 cm kitérésű forgó rázógépen. Az egyes lombikok tartalmát 8500 ford./perc sebességgel 3 percig centrifugáljuk és az oldatot a szilárd anyagról lefejtjük, A felülúszó fermentlevet Vibrio percolans teszt-mikroorganizmus használatával biológiai vizsgálatnak vetjük alá. A vizsgálatokat a következő táblázat szemlélteti: 5
