165752. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a B-5050 és a tetrahidro-B-5050 antibiotikum észtereinek előállítására

11 16S7S2 Az említett előnyökön túl a találmány szerinti eljárással előállítható észterek kedvezőbben használhatók perorális adagolásra, minthogy kevésbé keserűek a kiindulási vegyületeknél. 5 A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör. korlátozása nélkül. A I—VII példákban a kiindulási anyagok fermentációs úton való előállítását, az 1—16. io példákban pedig a találmány szerinti eljárást mutatjuk be. A példákban a súly-térfogat arányon gramm/ml arányt értünk. I. példa 500 ml előfermentációs tápoldatot, amelynek pH-ja 7,0 és amely 2,0% glükózt, 3,0% oldható keményítőt, 1,0% szójabablisztet, 1,0% kukorica- 20 lekvárt, 0,5% „Polypepton"-t (kazein hidrolizátum, gyártja a Daigo Nutritive Chemicals Ltd., Osaka, Japán), 0,3% nátriumkloridot és 0,3% kalciumkarbonátot tartalmaz, és 500 ml vizet 2000 ml-es Sakaguchi lombikba töltünk és sterilizálunk. A 25 sterilizált tápközeget ferde agáron legalább 4 napig tenyésztett Streptomyces hygroscopicus (IFO-12995) törzzsel oltjuk be és 28C°-on percenkénti 115 rezgésszámú rázógépben inkubáljuk (a rezgés amplitúdója 10 cm) 48 órán át. 30 A kapott tenyészet 1000 ml-ét a továbbiakban előfermentációs tenyészetként használjuk. Az előfermentációs tenyészetet inokulumként hozzáadjuk egy 200 literes saválló acéltartályba betöltött és sterilizált, 7,0 pH-ra beállított táp- 35 oldathoz, amely 3,0% glukózt, 0,5% kukoricalekvárt, 1,0% zsírtalanított szójabablisztet, 0,5% nátriumkloridot, 0,05% magnéziumszulfátot, 0,3% kalciumkarbonátot és vizet tartalmaz. A tenyészetet 28 C°-on inkubáljuk 24 órán át 40 100 liter/perc teljesítményű levegőztetéssel és 200/perc fordulatszámú keverés mellett. Az így kapott fermentációs tenyészet 100 literét át visszük az előbbi tápoldattal azonos összetételű fő tápoldat 1000 literébe, amely egy 45 2000 literes saválló acéltartályba van betöltve. A tenyészetet 28 C° inkubáljuk 66 órán át 1000 liter/perc levegőztetés és 120/perc fordulatszámú keverés mellett. Az inkubáció közben habzásgátlóként „Actocol"-t (56 hidroxilszámú 50 polioxipropilén keverék, gyártja és forgalombahozza a Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japán) adunk a fermentléhez a teljes térfogatra számított 0,05% mennyiségben. Az így kapott fermentlé antimikrobiális aktivitása a kísérleti 55 mikroorganizmusként használt Bacillus subtilis törzzsel szemben hígítási egységenként 350 egység. A meghatározást Waksman: „Microbial Antagonisms and Antibiotic Substances" c. könyvének 66-73. oldalain leírt módszerrel végeztük. 60 A fermentlevet leszűrjük, a 950 liter térfogatú szűrlet pH-ját 2n vizes NaOH oldattal 8,5-re állítjuk, és a fermentlevet 300 liter etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos fázist elválasztjuk, vízzel mossuk és 2 x 70 liter 0,005 n HCl oldattal 65 extraháljuk. A vizes extraktumokat egyesítjük, a pH-t híg vizes ammóniával 8,5-re állítjuk be, majd újra extrahálunk 2 x 45 liter etilacetáttal. Az extraktumokat vízzel mossuk, megszárítjuk és vákuumban 50 ml térfogatra betöményítjük. A tömény oldathoz 750 ml n-hexánt adunk, és ekkor 95 g B-5050 antibiotikum-keveréket kapunk nyers por alakjában. A porszerű terméket 450 ml benzolban oldjuk melegítés közben. Az oldathoz melegítés közben 2 g aktív szenet adunk, azután leszűrjük és a szűrletet lehűlni hagyjuk. Lehűlés közben színtelen tűkristályok alakjában 19 g B-5050 antibiotikumkeverék válik ki az oldatból. A kristályos B—5050 antibiotikumkeverék lOg-ját 50 ml etilacetátban oldjuk és 450 g szilikagélen oszlopon kromatografáljuk. (A szilikagél a Merck AG. NSZK gyártmánya, szemcseméret határai 0,05-0,2 mm.) Eluálószerként 2 :1 arányú etilacetát-benzol elegyet használunk. Az antimikrobális aktivitást mutató eluátum első 600 ml-ét szárazra pároljuk és a maradékot feloldjuk forró benzolban. Állás közben az oldatból 1 g színtelen kristály válik ki, mely túlnyomó részt B—5050—A antibiotikumból áll. A kolonnát tovább eluáljuk etilacetát-benzol eleggyel, és 4 liter eluátum leszedése után az eluciót 3 liter etilacetáttal folytatjuk. Az összegyűjtött eluátumokat azután vákuumban bepároljuk, és a maradékot forró benzolban oldjuk. Az oldatból állás közben 550 mg színtelen kristályos anyag válik ki, amely túlnyomó részt B-5050-F antibiotikumból áll. A túlnyomó részt B—5050-A antibiotikumot tartalmazó kristályos termék 500mg-ját 1,5 ml etilacetátban oldjuk és az előbbiekhez hasonló módon újra kromatografáljuk egy 50 g súlyú szilikagéllel töltött oszlopon. Eluálószerként 1 :1 arányú etilacetát-benzol elegyet használunk. Minden frakciónál vizsgáljuk a hatóanyagtartalmat. A vizsgálatot vékonyrétegkromatográfiásan végezzük, mimellett adszorbensként szilikagélt („HF254" jelű adszorbens, gyártja és forgalombahozza a Merck AG. NSZK), futtatószerként 3 :2 arányú benzol-aceton elegyet használunk. A kizárólag B—5050—A antibiotikumot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot benzolból átkristályosítjuk, amikor is 88,5 mg B—5050—A antibiotikumot kapunk színtelen prizmás kristályok alakjában. A túlnyomó részt B—5050—F antibiotikumot tartalmazó kristályos termék 350 mg-ját az előbbiekhez hasonló módon 50 g szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot előbb 700 ml 2:1 arányú etilacetát-benzol eleggyel eluáljuk, majd az eluciót 3 :1 arányú etilacetátbenzol eleggyel folytatjuk, miközben a frakciókban vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk a hatóanyagokat. A kizárólag B—5050—F antibiotikumot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot kristályosítjuk, és ekkor 75,6 mg B—5050—F antibiotikumot kapunk színtelen prizmás kristályok alakjában. 6