165737. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-triptofán enzimes előállítására
3 165737 4 enzim reakcióelegybe való kijutását és diszpergáltatását, ugyanakkor lehetővé teszi, hogy az enzim aktivitását kifejtse. Az enzim beágyazására alkalmas polimerek között megemlíthetők az észterezett cellulóz- 5 polimerek, nitrátok, poliolefinek, akrilnitril polimerjei és kopolimerjei, akrilát, metakrilátok, vinilészterek, vinilklorid, vinilidénklorid, sztirol, poliamidok, polivinilbutirál, és hasonlók. A legjobb eredményeket cellulóztriacetát és E. 10 Coliból előállított enzim alkalmazásával értük el. A beágyazott enzim hosszú élettartamúnak bizonyul:, aktivitását munkakörülmények között vizsgáltuk, és hat hónap leforgása alatt nem veszített aktivitásából. 15 E körülmény jelentősen csökkenti vagy elenyészően kis értékűvé teszi a katalizátorkészítés költségét az egész eljárás költségvetésében. Lehetővé teszi igen tiszta enzimvegyületek használatát, melyek a továbbiakban igen aktívaknak 20 bizonyultak. A beágyazott enzim nem diffundál a reakcióelegybe: ennek köszönhető, hogy nem merül fel az eltávolítás problémája, és a végső triptofán oldat nem tartalmaz szennyezést, ami az extrák- 25 ciót a fermentációs eljáráshoz hasonlóan megnehezíti. A fermentációs eljárásban viszonylag nagy mennyiségben keletkeznek egyéb aminosavak, elsősorban alanin és valin, és jelen van még a közeg szennyezése. Az enzim csak a szerin 30 L-formáját hasznosítja, ezért a reakcióelegyben felhasználható a D, L. -szerin. A nem használt D-szerin jó hozammal kinyerhető, kémiai módszerrel racemizálható és visszavihető a rendszerbe. 35 A találmány szerinti eljárás nem igényli az L-triptofán mikrobiológiai termeléséhez szükséges mikroorganizmus kiválasztását és tartósítását, továbbá nem szükséges táptalajról gondoskodni. A 40 találmány szerinti eljárás másik jelentős előnye, hogy lehetővé teszi a folyamatos munkát, ez egyszerűbbé teszi a berendezést és csökkenti az eljárás költségeit A fermentáció szükségszerűen olyan bonyo- 45 lultabb készüléket igényel, mely lehetővé teszi a keverést, levegőztetést, a fermentlé sterilizálását, és a folyamat fizikai változóinak megfelelő ellenőrzését. A találmány tárgyát képező eljárásunk szerinti 50 előállításhoz elégséges egy vagy több acél- vagy műanyagkolonna és szivattyú használata. A munka szakaszos végzése lehetséges oly módon, hogy a szubsztrátumot és az enzimet szükséges ideig érintkeztetjük, a terméket el- 55 távolítjuk és új szubsztrátumot viszünk be ugyanarra az enzimes szálra. A szál ily módon korlátlan munkafolyamatban felhasználható. A munka folyamatos megoldásában egyrészt lehetséges az enzimes szállal katalizált reakció 60 véghezvitele, másrészt a reakcióban keletkező L-triptofán ismert módszerekkel kinyerhető, például adszorpcióval aktív szénen, ioncserélő gyantákon vagy egyszerű kristályosítással, amikor a telítés körülményeit elértük. 65 A találmányt közelebbről a következő példák szemléltetik, anélkül azonban, hogy hatóterülete azokra korlátozódnék. 1. példa 70 g E. Coli sejtet - melyet Davis minimál-táptalajon tenyésztettünk, kismennyiségű indollal 140 nű foszfátpufferhez adagolunk (10~2 mól EDTA, 10"4 mól piridoxál-foszfát, pH = 7,8). A szuszpenziót ultrahanggal kezeljük, majd centrifugáljuk. A lombikot 53 C° hőmérsékletre melegítjük, és 3 percen át ezen a hőmérsékleten tartjuk, majd újból centrifugálunk. A fehérjéket 0C° hőmérsékleten ammóniumszulfátban 0,30-0,50 telítési fokon kicsapjuk, foszfátpufferben feloldjuk (10~2 mól EDTA, 2X10"5 mól D,L-szerin, 4X10 -4 mól piridoxálfoszfát, 30 térf.%/térfogat glicerin). A kapott oldat ml-ként 32 mg fehérjét és 110 egység, a triptofán szintézisére alkalmas enzimet tartalmaz, a fehérje 1 mg-jára számítva (1 egység az a mennyisége az enzimnek, mely 25 C° hőmérsékleten 30 perc alatt 0,1 mmól L-triptofán keletkezését katalizálja). 20 g cellulóztriacetátot (Fluka A. G. Chemische Fabrik terméke, CH-9470 Buchs, Svájc) keverés közben feloldunk 265 g metilénkloridban (Carlo Erba S. p. A. terméke, Via Imbonati 24, Milano, Olaszország). Az előbbiekben említett polimer oldathoz 30 ml enzimes oldatot adunk. A két fázist 0C° hőmérsékleten 30 percig erőteljesen keverve emulziót kapunk. Az emulziót 0C° hőmérsékleten tartott ömlesztőbe öntjük, nitrogéngáz nyomás alá helyezzük, majd szobahőmérsékleten toluolban koaguláltatjuk. A szálat a toluol eltávolítására vákuumban szárítjuk. Ezután a szálat két-literes hengeres reaktorba helyezzük, a reaktort 25 C° hőmérsékletű vízbe merítve saját tengelye körül forgatjuk. A reaktorba 10 g enzimtartalmú szálat és 1 liter reakcióelegyet viszünk be. A reakcióelegy 20 mg/ml DL-szerint, 2 mg/ml piridoxál-foszfátot tartaímaz 0,01 mól foszfátpufferben, pH-érték 7,8. Csekély oldódása miatt az indolt porítjuk és szilárd anyagként tápláljuk a reaktorba. Az enzimtartalmú szálat nyolc óra hosszat érintkeztetjük a reakcióeleggyel, ezután a folyadékot eltávolítjuk és újabb reakcióeleggyel helyettesítjük, ugyanazzal a szállal több munkaciklus végezhető. Egy körfolyamat végén a reakcióelegyben 7,9 g L-triptofán keletkezik. 150 munkaciklus után a körfolyamatonként termelődő L-triptofán mennyisége mindenegyes ciklusban gyakorlatilag állandó - 7,7 gr. 2
