165705. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sertés száj- és körömfájás vírus tenyésztésére és oltóanyag előállítására IB-RS-2 sejteken
165705 5 6 Vitaminok mg/liter D-kalcium-pantotenát 1,0 Kolin-klorid 1,0 Fólsav 1,0 i-inozit 2,0 Nikotinsav- amid 1,0 Piridoxál. HCl 1,0 Riboflavin 0,1 Tiamin. HCl 1,0 Lúgos sóoldat mg/liter KCl 400,0 NaCl 6800,0 NaHC03 2200,0 NaH2 P0 4 -H 2 0 1500,0 MgCl2 .6H 2 0 200,0 Dextróz 1000,0 Fenolvörös 10,0 Egy keverővel és szellőztetővel ellátott reaktorba 200,000 sejt/ml töménységű sejtszuszpenziót teszünk. A tenyészetet 37 °C-on tartjuk és ezalatt 300 fordulat/perc sebességgel keverjük. A pH értékét a levegőztetéssel 7,0J;0,1 értéken tartjuk. A tenyésztőfolyadékot minden harmadnap cseréljük. A találmány szerinti eljárás másként úgy foganatosítható, hogy harmadnaponként friss közeggel történő hígítással meghatározott sejtkoncentrációt tartunk fent. Ilyen feltételek mellett a sejtek száma a kezdeti 200 000/ml-ről 8 nap után 800 000/ml-re emelkedik. Ez 8 nap alatt négyszeres szaporodásnak felel meg. Ezután a kapott sejtszubsztrátot beoltjuk egy tisztítatlan sertés nyirokból vagy ugyanezen állat fertőzött véréből származó oltóvírussal, amelyet több egymásután következő menetben IB—RS — 2-sejteken vagy tetszőleges más sejteken, mint pl. sertésvese primer sejtjein, folytatólagos sorban kapott sertéssejteken, vagy tetszőleges, az MKS-vírussal szemben érzékeny heterológ sejteken, pl. BHK-sejteken, borjiivese elsődleges tenyészetén futtatunk. A menetek száma 4 és 20 közt lehet, de figyelembevéve az Office International des Epizooties javaslatát (1969), a vírusokat előnyösen 4 vagy 5 menet után használjuk a sejttenyészetben. A vírus optimális tenyésztési idejét egy rétegben történő tenyésztés esetében egyrészt a szaporodás kinetikájától, másrészt az immunológiai teszt eredményeitől függő optimális szaporodásból és az antigenitásból kísérleti állatokon vagy sertéseken határozzuk meg. Az optimális szaporodást a fertőzés és a kvantitatív szerológiai reakciók kritériumként való figyelembevételével állapítjuk meg. A fertőzöttséget fiatal sertésvese vagy marhaembrió vagy IB—RS— 2-sejtek elsődleges tenyészetén az úgynevezett sejtfertőzési hatás vizsgálatával vagy a plakk-képződési hajlam agar-rétegen végzett vizsgálatával határozzuk meg. Az optimális fertőzöttségi titer-ebben az esetben 0,1 ml-ként 106 és 10 7 . A fertőzöttségi titer tengerimalacon vagy egereken is meghatározható. ' A szerológiai tulajdonságok vizsgálata az úgynevezett komplementkötési reakcióval történik. Az eredményeket vagy azzal az antigénhígítással fejezzük ki, mely a két komplement egység 100%-át 5 köti, vagy azzal az antigónhígítással, mely a reakcióban résztvevő két komplementegység 50%-át köti. Az ily módon kapott antigének 1/4-es vagy 1/8-as hígítástól 1/32-es hígításig terjedően a két komplementegység 100%-át kötik. Ez a szerológiai komple-10 mentkötési reakció nyers vírusokon vagy előzetesen alifás klór-fluorszénhidrogénekkel, előnyösen freonnal vagy halogénezett szénhidrogénekkel tisztított víruson végezhető el. Azt találtuk, hogy az optimális tenyésztési idő 15 a kevéssé alkalmazkodott vírusokra nézve (4—6. menet) általában 16 óra, de a vírusoktól függően 10 és 20 óra közt változhat. A több, pl. 20 sejttenyésztési meneten átment vírusoknál a tenyésztési idő lerövidül. A tenyésztési idő ekkor mintegy 8 óra, 20 és vírusoktól függően 6 és 12 óra között mozoghat. Az immunológiai tesztek eredményei alapján továbbá azt találtuk, hogy a képződött vírusok minősége a tenyésztő sejttömeg élő sejtjeinek számától függ. Az egyrétegű tenyészet optimuma 25 300 000 és 600 000 sejt/cm2 érték közt van. Ez 40 000—60 000 sejt/cm2 tartalmú kiindulási szuszpenziónál 3 vagy 4 tenyésztési nap után elérhető, A kinyerés után a vírusszuszpenziót a sejttörmeléktől megtisztítjuk és bakterológiai szűrési eljárás-30 sal vagy kémiai kezeléssel, pl. kloroformmal vagy triklóretilénnel történő kezeléssel sterilizáljuk. A sterilizáció után a sejtszuszpenziót 0,02—0,03 súly %-os tiszta formaldehiddel 36 °C-on inaktiváljuk. Az inaktiválás 0,005 %-os glicidaldehiddel 35 25 °C-on 16 órán át kezelve vagy acetil etiléniminnel is elérhető. Az inaktiválási eljárások a következő közleményben találhatók: M. Durand: Bull. Off. Int. Epiz. 1968, 69 (3—4), 429—465. Az inaktivált vírus emulgeálására segédanyag-40 ként olajat használunk, és víz az olajban, vagy olaj a vízben vagy vegyes olaj a vízben víz az olajban típusú emulziót készítünk. Ez utóbbi esetben a 10% anhidrohexitoleátot (Arlacel) tartalmazó hagyományos Mayolin keverékhez „Tween" típusú emul-45 geátort vagy tetszőleges más, olaj a vízben emulziót képző anyagot, előnyösen az „Emulgine" nevű, egy poliglikoléterből és egy zsíralkoholból álló speciális keveréket adunk. Az emulziókat centrifugálással szemben tanúsí-50 tott állandóságuk, fajlagos ellenállásuk, vízben mutatkozó diffúziós tulajdonságaik és egy meghatározott átmérő-nyílású tűn keresztül való átfolyásuk ideje szempontjából, valamint mikroszkópos megfigyeléssel vizsgáljuk. 55 Az oltóanyag ártalmatlanságát a sertés fajon próbáljuk ki. Ezenkívül az oltóanyag antigenitását ugyanezen a fajon az Office International des Epizooties által közölt normák szerint határozzuk meg (J. POUL. 60 BULL. Off. Int. Epiz. 1964. 61, 1233 és M. Giraud, Bull. Off. Int. Epiz. 1969, 71, 285—306). Példa A sertésfajnak kiváló immunitást biztosító száj-65 és körömfájás elleni oltóanyag előállítása 3
