165579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-( D-5-amino-5-karboxi-vleramido) -3- (karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav antibiotikum előállítására
5 165579 6 zegben használt szénhidrát-forrás vagy források pontos mennyisége részben a tápközeg egyéb összetevőitől függ. Ugy találtuk azonban, hogy a tápközeg súlyára számított 1—6% körüli szénhidrátmennyiség elegendő. Egyedüli szénfonás is 5 használható, vagy több szénforrás is kombinálható a tápközegben. Megfelelő nitrogénforrásként szolgál számos fehérjeanyag, mint a kazeinhidrolizátum, szójababliszt, kukoricalekvár, desztillációs maradékok, 10 élesztőtermékek, paradicsompüré és hasonlók. A különböző nitrogénforrásokat használhatjuk önmagukban vagy egymással kombinálva, a vizes közeg súlyára számított 0,2—6% mennyiségben. A jelen találmány leírásában hasznait „komplex is szerves közegek" kifejezésen olyan közegeket értünk, amelyekben nem minden alkotórész kémiailag definiált. Példaként említjük erre a zabból, szójabablisztből, nátriumcitrátból, poliglikolból és desztillációs maradékokból álló kö- 20 zegeket. A fermentálást 20-37 C° közötti hőmérsékleten végezzük, optimális eredmények elérésére azonban a fermentálást előnyösen 24—32 C° között végezzük. A Streptomyces lactamdurans tenyészet 25 szaporodásához és az antibiotikum termeléséhez alkalmas közeg pH értékének 6,0—8,- között kell lennie. A 7-[D-5-amino-5-karboxivaleramido(-3-)karbamoiloximetil]-7-metoxi-3-cefém-4 karbonsavat az I. 30 szerkezeti képlettel ábrázoljuk. Az I. képletű vegyületet az előbbiekben ismertetett aerób fermentálás alatt az említett vegyület termelésére képes Streptomyces lactamdurans törzs, például a Northern Utilization 35 Research and Development Branch vállalatnál az NRRL 3802 letéti számon tartós letétbe helyezett törzs termeli. E fajok más törzsei, például mutációt okozó szerekkel létrehozott vagy a természetből elkülönített mutánsai is használhatók. 40 Az I. képletű antibiotikum amfoter tulajdonságú, látszólagos izoelektromos pontja 3,5 pH körül van, és oldata 1,5-9,0 körüli pH értéken stabil. Az antibiotikum és sói nemcsak a penicillinázzal, hanem a cefalosporinázokkal szemben is 45 rezisztensek, és fokozott aktivitásuk a Gramnegatív mikroorganizmusokkal szemben. A viszonylag kis baktériumölő aktivitású cefalosporin C-vel ellentétben a találmány tárgyát képező antibiotikum és sói jelentős „in vivo" Gram- 50 negatív hatást fejtenek ki a cefalotint általában jóval felülmúló aktivitással. Ez az aktivitás a Proteus morganii-ra gyakorolt „in vivo" hatásban, továbbá a következő Gram-negatív baktériumok: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mira- 55 bilis, Salmonella schottmuelleri, Klebsiella pneumoniae AD, Klebsiella pneumoniae B és Paracolobactrum arizoniae elleni hatékonyságban nyilvánul meg. Az antibiotikum biológiai értékelését korong- 60 -vizsgálatokkal végezzük 9,5 mm átmérőjű szűrőpapír-korongok használatával. Az értékelő-korong készítéséhez lemezenként Difco tápagart és 2,0 g/liter Difco élesztőextraktumot (Difco Company, Detroit, Michigan) használunk 10 ml mennyiség- 65 ben. A vizsgálati mikroorganizmus, Vibrio percolans MB-1272 egy éjszaka alatti szaporulatát steril sóoldatban oldjuk, és olyan szuszpenziót készítünk, melynek 660 mii hullámhosszon 40%-os transzmissziója van. A lemezre öntés előtt e szuszpenzióból literenként 20 millilitert adunk a közeghez. A Vibrio percolans mikroorganizmus az American Type Culture Collection gyűjteményében van letétbe helyezve és a következő jelzéssel igényelhető: Vibrio percolans, ATCC 8461. A vizsgálati lemezeket felhasználásukig (legfeljebb 5 napig) 4 C° hőmérsékleten tartjuk. Az antibiotikummal telített vizsgálati korongokat alkalmazás előtt 8-24 óra hosszat 28 C hőmérsékleten inkubáljuk. A gátlási zónák átmérőjét milliméterben olvassuk le. Ezek a relatív hatás meghatározására szolgálnak, vagy tisztított sztandard anyaggal összehasonlítva a hatást jug/ml-ben fejezzük ki. A tiszta 7-[D-5-amino-karboxivaleramido(-3-)karbamoiloximetil]-7-metoxi-3-cefém-4- karbonsavnak a fermentleben levő nagymennyiségű szennyezéstől való elkülönítésével járó nehézségei miatt nagy jelentősége van annak, hogy növeljük — a fermentlé összmennyiségéhez képest — az antibiotikum koncentrációját. Ennélfogva a jelen találmány tárgya eljárás az I. képletű antibiotikum előállítására oly módon, hogy a hozam növekedjék a fermentálás folyamatában. A találmány tárgya tehát olyan módszer, amelynek során az antibiotikum hozamának növelésére a fermentálás folyamatában viszonylag olcsó, könnyen hozzáférhető kémiai adalékanyagot használunk. Rájöttünk arra, hogy glicin, L-fenilalanin, a II. általános képletű karbamát vagy a ül. általános képletű amid, mely képletekben R jelentése kis szénatomszámú alku-csoport, mint az etil-, n-propil- vagy n-butilcsoport, Rí és R2 jelentése lehet azonos vagy különböző, például hidrogénatom, valamely kis szénatomszámú alku-csoport, mint metil-, etil-, n-propil- vagy n-butil-csoport, vagy hidroxi-(kis szénatomszámú)-alkil-csoport, például a 2-hidroxietil- vagy 3-hidroxipropil-csoport, R3 jelentése hidrogénatom, valamely 1-11 szénatomszámu alku-csoport, például metil-, etil-, n-propil-, n-butil-, n-pentil-, vagy undecil-csoport, valamely (kisszénatomszámú)-alkil-karbonil- (kis szénatomszámú>alkü-csoport, például 2-oxopropilcsoport, vagy fenil-csoport, R4 és R5 jelentése lehet azonos vagy különböző, nevezetesen hidrogénatom, kis szénatomszámú alku-csoport, mint a metil-, etil-, n-propil-, n-butil-, izobutil-, vagy n-pentil-csoport, vagy hidroxi(kis szénatomszámú)-alkil-csoport, például a 2-hidroxietil- vagy 3-hidroxipropil-csoport, 3
