165526. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-4696-jelű új antibiotikum előállítására
11 165526 12 a táptalajon átáramoltatott levegő térfogata legalább V2 térfogat levegő/táptalajtérfogat. Az A—4696 jelű antibiotikum keletkezésének sebességét és koncentrációját a termelő szakasz során, az antibiotikumra érzékeny mikroorganizmusok felhasználásával, biológiai értékméréssel követjük. A találmány szerinti eljárás részletes ismertetése során megadott eredményeket olyan értékméréssel kapjuk, ahol Bacillus subtilis tesztorganizmussal szemben mértünk. A biológiai értékmérés kivitelezésére standard zavarosság, vagy az ismert papírkorongos és agardiffúziós módszereket használhatjuk. Az antibiotikum koncentrációja a 3—6. napon éri el az elérhető legmagasabb értéket mind rázott lombikos tenyészetbén, mind süllyesztett aerob fermentációs körülmények között. A fermentáció befejezése után a hatóanyagot a fermentlé többi alkotórészétől adszorpciós vagy extrakciós úton különítjük el. Előnyösen adszorpciós módszert használunk, ezzel ugyanis elkerüljük az igen nagymennyiségű oldószer használatát. A fermentáció befejezésekor a hatóanyag a fermentlében és a micéliumokon van jelen. A tenyészetet megszűrjük, ezzel elkülönítjük a micéliumtömeget a fermentlétől. A micéliumot vízzel mossuk, majd vízben szuszpendáljuk, és 5,0 N NaOH-dal a pH-t 10,5-re állítjuk. Ezután a szuszpenziót 30 percen át erőteljesen keverjük, majd megszűrjük. A két szürletet és a mosófolyadéköt egyesítjük, majd a hatóanyagot előnyös adszorbensen (aktivált szén, aktivált alumíniumoxid, poliamid alapú gyanta, cellulóz, szilikagél és hasonlók) adszorbeáltatjuk. Az adszorpciót végezhetjük úgy, hogy a hatóanyagot tartalmazó oldatot átengedjük az adszorbenssel töltött oszlopon, vagy úgy is, hogy az oldathoz adjuk a megfelelő adszorbenst, a szuszpenziót 20—30 percen át kevertetjük, majd a hatóanyagmentes oldatot szűréssel eltávolítjuk. Az adszorbensre kötött antibiotikumot ismert módon eluáljuk, miután megkapjuk a nyers A—4696 jelű anyagot. A nyers A—4696-ot oly módon tisztítjuk, hogy előállított pikrát sóját sósavas sóvá alakítjuk, vagy oly módon, hogy előnyös adszorbensre vagy ioncserélő gyantára visszük fel, majd eluáljuk. Előnyös adszorbensként poliamid alapú gyantát (Woelm, M., Eschwege, NSzK), alumíniumoxidot (savas, semleges és bázikus), szilikagélt, Amberlite XAD—2 (Rohm és Haas, Philadelphia), Amberlite XAD—4 í(Rahm és Haas, Philadelphia), vagy Dowex 50 (H+) (Dow Chemical, Midland, Michigan) ioncserélőket használunk. A találmány szerinti eljárás kivitelezését a következő példákkal szemléltetjük. Egyes táptalaj-alkotórészeket az alábbiakban pontosabban definiálunk: Szárított cefre: Az alkoholos desztiUáció során a desztillációs maradékban a szilárd részek kiszűrése után visszamaradt oldott anyagok vagy finom részecskék, melyet szárítanak és így a kapott anyag például állati táplékokban vitamin- és ásványi anyag forrásként használható. Kifőzött zabliszt: zabliszt, melynek főzése so-5 rán a keményítő 70—80%^a hidrolizál. Szárítva alkalmazzuk. Dextrin: Burgonyakeményítőnek hő, savak vagy enzimek hatására történő lebontása során keletkezett poliszacharidok elegye, melyek molekulasúlya tág határok között 10 változik. Szárítva alkalmazzuk. Melasz: a nyers répacukor tisztítása során keletkezett szirupos melléktermék; összetétele a cukor minőségétől függően változik. Répacukor: Beta vulgaris-ból nyert szacharóz. Kukoricalekvár: szárazanyag-15 tartalma 54%. 1. példa: A) Az A—4696 jelű antibiotikum előállítása 20 rázott tenyészetben. Az Actmoplanes speciesbe tartozó ATCC 23 342 jelű törzs micéliumával a következő öszszetételű ferde^agar-táptalajt oltjuk bé: 25 30 * Czapek ásványi^sóoldata a következő össze-35 tételű: KCl 100 g MgS04 -7H 2 O 100 g FeS04 -7H 2 0 2 g (2 ml konc. HCl-ben oldva) desztillált víz 1 liter 40 45 50 55 60 kifőzött zabliszt 60 g élesztőkivonat 2,5 g K2HPO4 1,0 g szárított cefre 5,0 g Czapek ásványi-sóoldata* 5,0 ml agar 25 g desztillált víz 1 liter A ferde táptalajt az ATCC 23 342 jelű törzszsel oltjuk, és 6 napon át 30 C°-on inkubáljuk. A tenyészet a fenti táptalajon nem spórázik, gyengén nő, így célszerű megfelelő oltókaocsal szélesztve megnövelni a fejlődő telepek számát. Az érett tenyészetből steril desztillált vízzel és üvegbottal micéliumos szuszpenziót készítünk. Az ily módon kapott szuszpenzióval 100 ml steril, az alábbi összetételű táptalajt oltunk: glükóz 5,0 g dextrin 20,0 g szójaliszt 15,0 g élesztőkivonat 2,5 g kaldumkarfoonát 1^0 g csapvíz 1 liter A beoltott táptalajt tartalmazó lombikot 48 órán át, 30 C°-on 250/perc fordulatszámú rázóasztalon rázatjuk. A kinőtt vegetatív tenyészet 10 ml-ével az alábbi összetételű táptalaj 100 ml-ét oltjuk, 6
