165478. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyagcseretermékek előállítására növényi sejtekből fermentációval

165478 13 14 szűk fel, majd a kromatogramot aklohexán-aceton-jégeeet 50:50:2 arányú elegyével fejlesztjük ki. Kifejlesztés után a vékonyréteg lemezt szárítjuk, majd vanillinnek 50'%-os foszforsavval készült telített oldatával befújjuk. A befújt lemezt 120 °C-os szárítószekrénybe helyezzük, 15 perc eltelte után Rf 0,32 és Rf 0,50-nél sötét kékesszürke foltok jelennek meg az összehasonlításként felcseppentett digitoxinhoz és digoxinhoz hasonlóan. További, nem azonosított szteroid-glükozidák Rf 0,0, 0,05 és 0,80 értékkel jelennek meg. 10. példa Differenciálatlan Datura stramonium sejttenyészet készítése Cserépben tenyésztett Datura stramoniummagoncokat 1 cm-rel a talajfelszín felett levágunk, a hajtásokat 1 percig 1%-os nátrium-hipoklorit-oldatba mártva, felületüket sterilezzük. A hajtásokat steril vízzel mossuk, majd 5 mm2-es levélrészecskéket 10 cm átmérőjű Petri-csészékben levő G (Gamborg) agartartalmú táptalaj felületére visszük. 10 15 20 25 11. példa Datura stramonium sejtek differenciálódása, gyökérkezdemény tenyésztése Differenciálatlan, diszperz, előbbi példa szerint nyert Datura stramonium sejttenyészetet 6 nappal a legutolsó átültetés után aszeptikusán 100 mikronos nylo'nszitán leszűrünk. A sejtanyagot 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav-mentes G táptalajjal mossuk, majd az így kapott auxinmentes sejteket öt különböző, 0,002, 0,004, 0,00ö, 0,016 és 0,032 mg/l 2,4-dikló:r-fenoxi-ecetsav növekvő koncentrációjú G táptalajt tartalmazó edénybe oltjuk. Ezeket az edényeket 10 napig 28 °C-on, csökkentett fényben rotáló rázógépen inkubáljuk; ez alatt az idő alatt a 3 legkisebb auxinhatást mutató szuszpenzióban számottevő gyökérkezdemény kialakulása figyelhető meg. 12. példa Hiosciamin és/vagy a racém atropin elkülönítése Datura stramonium differenciálódó sejttenyészetéből G táptalaj összetevők Koncentráció mg/l kálium-nitrát 2 500 ammóniurcHszulfát 134 nátrium-dihidrogén-foszfát H2O 150 magnézium-szulfát 7 H2O 250 kalcium-klorid 2 H2O 150 vas(II)-etilón-diamin-tetraeoetsav 28 mangán^szulfát H2O 10 bórsav 3 cink^szulfát 7 H2

0 2 nátrium-molibdát 2 H2O 0,250 réz-szulfát 5 H2O 0,025 kobalt-klorid 6 H2

0 0,025 káMuna-jodid 0.75 meso-inositol 100 nikotinsav 1 tiamin 10 piridoxin 1 szacharóz 20 000 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav 1 kinetin 0,060 30 35 40 A pH-t célszerűen 5,5-re állítjuk. 5 hétig 28 "C-om, sötétben inkubálva, a levélmetszetek felületén és szélén erőteljes hegcsomők fejlődnek ki. Néhányat ezekből elkülönítünk, és aszeptikusán 50—50 ml G táptalajt (fenti összetétel, agar nélkül) tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-loinibikba viszünk, és ezeket 25 °COTí, mérsékelt fényben, rotáló rázógépen inkubáljuk. A megnövekedett differenciálatlan sejteket 14 naponként átoltjuk (a jobban diszpergált anyagot válogatva). Három átültetés után kedvező tulajdonságú egysejt- és sejtcsomótenyészethez jutunk. Fenti szuszpenziók egyikét (eredetileg 0,004 mg/l 2,4-diiklár-fenoxi~eeetsav-tartalommal rendelkezőt) bordázott szűrőpapíron leszűrjük, az összegyűjtött gyökérkezdemény-tömeget vízzel mossuk, a kinyert (7 g nedves) szövetet 5 ml 0,1 n kénsavoldattai szétdörzsöljük. A tiszta folyadékot centrifugálás segítségével elválasztjuk, ezt tömény ammónium-hidroxiddal meglúgosítjuk és háromszor, egyenként 10 ml kloroformmal kirázzuk. Az egyesített kloroformos kivonatokat 2 ml 0,1 n kénsavoldattal kirázzuk, a kapott tömény alkaloidaoldatot tömény ammónium-hidroxiddal meglúgosítjuk, majd 0,6 ml kloroformmal kirázzuk. A kloroformos kivonatot 50 mikroliterre bepároljuk, majd a teljes mennyiséget szilikagél vékonyréteg^kromatogram lemezre visszük. A felvitt anyagot kloro-45 form-dietilamin 9:1 arányú elegyével fejlesztjük ki, ezt követően a lemezt megszárítjuk, jód-platinát-oldattal befújjuk (0,5 ml 10%-os PtCl2

-oldat és 25 ml 2%-os KJ-oldat elegye), amikor több alkaloida foltja jelenik meg; a legerősebb Rf 50 0,45 értékkel, az összehasonlításként felcseppentett atropinnal azonos helyen jelentkezik. A Datura stramoniumban természetes állapotban az optikailag aktív 1-hioszciamint találjuk, amit' a gyógyászatban általában az atropin néven is-55 mert raoém alakjaként alkalmaznak. Kromatográfiásan az aktív és a racém alak nem választható el. 60 13. példa Datura stramonium differenciálódása, teljes növényi kezdemény tenyésztése 2 mg/l 2,4-diklói

r-fenoxi-ecetsavat tartalmazó 65 rázóedényben levő G táptalajba Datura stramo-