165465. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az AT-125 jelű antibiotikum előállítására

165495 15 16 ratóriumi berendezések tisztításiára mikológiái laboratóriumokban. Az AT—125 aktív az L 1210 számú, egerekben kiváltható kísérleti fehérvérűség ellen, és így e betegségben szenvedő laboratóriumi egerek gyógyítására hasznosítható. A találmányt közelebbről a következő példával világítjuk meg. Példa a) Fermentálás Strep tomyoes sviceus NRRL 543© talaj tenyészetével 500 ml űrtartalmú Erlenmeyer-palackoíkban 100—100 ml, következő összetételű táptalajt oltunk be: Dextróz 25 g/liter Fharmamedia1

25 g/liter Csapvíz 1 literre feltöltéshez 1 Gyártó oég: Trader's Oil Mill Company, Forth "Worth, Texas, Amerikai Egyesült Államok. Az oltóközeget pH 7,2^en elősterilizáljuk, majd a beoltott oltóközeget két napon át 28 °C-on Gump-típusú forgó rázógépben 250 fordulat/perc sebességgel forgatva rázatjuk. A fenti módon kapott oltóközeggel 500 ml űrméretű Erlenmeyerlombikba töltött 100—100 ml mennyiségű steril táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő : Kalcium-karbonát Nátrium-klorid Keményítő Mannit Phytone1 KaySoy2 Lardolaj Csapvíz 5 g/liter 2 g/liter 10 g/liter 10 g/liter 10 g/liter 10 g/liter 1 ml/100 ml 1 literre feltöltéshez 1 Szójaliszt pépes kivonata 2 Finomra őrölt, zsiradékmentes szójababliszt. Az elősterilizálási pH 7,2 értéket 0,4 n nátrium-<hidroxid-oldattal állítjuk be. A fermentálásra szolgáló Erlenmeyer-lomibikokat beoltjuk a fenti módon előállított oltóközegből 5 ml oltóközeg per 100 ml táptalaj arányban. A tenyésztést 2—3 napon át 32 °C-on végezzük Gump-típusú forgó rázógépen 250 fordulat/perc sebességgel rázatva. Az AT—125 maximális hozama palackban végzett fermentálás esetén általában 2 nap után érhető el, amikor is az antibiotikum titerje ug7 rásszerűen megnő. Rázott Erlenmeyer-lomfoikban végzett fermentálás tipikus hozam — idő görbéje a következő: Ora AT—T25 koncentrációja BE/ml-ben1 48 56 72 22 96 26 120 16 1 BE (biológiai aktivitásegység) fogalmát úgy definiáljuk, hogy 1 BE az a mennyiség, amely 2( mm-es inhibitálási zóna eléréséhez szükséges 12,7 mm-es korongon, ha a korongot az AT—12? 5 oldatánált 0,8 ml-jével kezeljük. b) Elkülönítés Az AT—125 fermentációs úton végzett előállításánál kapott 250 liter mennyiségű fermentlél közepes porozitású diatomaföldön szűrjük. A ka-10 pott tiszta fermentlét pH 7—<8 értéken 25 liter frissen regenerált Dowex 50X16 gyantával — mely hidrogénionokkal telített állapotban van — töltött kromatográfiás oszlopon bocsátjuk keresztül. Az oszlopot 50 liter ionmentes vízzel 15 mossuk, és 120 liter 1 n ammónium-ihidroxid-oldattal eluáljuk, ahol 6 literes frakciókat gyűjtünk. A legaktívabb frakciókat (inhibitálási zónájuk több, mint 50 mm) Bacillus subtilis (a fentiekben ismertetett összetételű mesterséges táp-20 talajon növesztett) tenyészetével töltött tálba mártott, majd levegőn megszárított korongokkal állapítjuk meg. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, és csökkentett nyomáson betöményítjük az ammónium-hidroxid fölös mennyiségének eltá-25 volítására. A szárazanyag-tartalom meghatározására végzett mérés tanúsága szerint az összes nyers vizes koncentrátum 2950 g anyagot, míg az aktív eluátumok 244 g anyagot tartalmaznak. Az aktív eluátumokból kapott szilárd anyag ak-30 tivitása mintegy tizenháromszorosa a tiszta fermentléből kromatografálás nélkül kapható szilárd anyag aktivitásának Bacillus subtilisszel végzett kísérlettel megállapítva. c) Tisztítás 35 1. Sztirol típusú, enyhén bázisos poliamin gyantával töltött ioncserélő oszlop. A Dowex 50X16 gyantával kapott aktív vizes koncentrátumot pH 7—7,5-en 4 liter Amberlite IR 45 márkanevű gyantával — amely hidroxil-40 ionokkal telített állapotban van — töltött ioncserélő oszlopra bocsátjuk. Az oszlopot 8 liter ionmentes vízzel, 4 liter 50%-os vizes metanollal és 8 liter 90%-os vizes metanollal mossuk, majd 0,5 n ecetsavval (90%-os metanolban) eluálunk, 45 ahol 2 literes frakciókat gyűjtünk. A Bacillus subtilisszel végzett kísérlettel megállapított legaktívabb frakciókat összegyűjtjük, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. így 9,40 g maradékot kapunk, melynek aktivitása Bacillus 50 subtilisszel mérve huszonnyolcszorosa a Dowex-gyantával kapott eluátum bepárlási maradéka aktivitásának. 2. Megoszlásos kromatográfia N-butanol, benzol, metanol és ionmentes víz 55 2:1:1:1 arányú elegyét keverjük, majd két fázisra szétválni hagyjuk, és a fázisokat elválasztjuk. 2340 g közepes porozitású diatomaföldet feliszapolunk a felső fázissal, majd a feliszapolt diatomaföldet az alsó fázis 900 ml-jével alaposan 60 összekeverjük, az így kapott zagyszerű keveréket kromatográfiás oszlopba töltjük, a keveréket ülepedve hagyva és az oszlopon a felső fázisból további mennyiséget keresztül engedve. Az Amberlite IR 45 gyantával végzett kroma-65 tografálás után kapott maradékot feloldjuk az