165387. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-(karbociklusos gyűrűvel kondenzált imidazolil)-rifamicin SV-származékok előállítására
165307 nak kifejezését kontrollálják. A virális vagy vírusok által transzformált sejtenzimek specifikus inhibitorai, és főképpen az RNS-tumorvírus-polimerázok inhibitorai jelentős szerepet játszhatnak a leukaemia és más rákos betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerek készítésénél. A találmány szerinti vegyületek gátló hatását egér sarcomavírusának RNS-függő DNS-polimerázán és tisztított enzimek DNS-függő DNS-polimeráz-aktivitásán vizsgáltuk. A gátló hatást C. Gurgo és társai [Nature, New Biology, 220, 111 (1971)] által ismertetett módszerrel vizsgáltuk. A gyógyszerek különböző koncentrációinak a polimer áz-akti vitásra kifejtett hatását úgy határoztuk meg, hogy 3H-dTTP-nak (tríciummal jelzett timindezoxiribozidtrifoszfát) az oldhatatlan frakcióba történő beépülését követtük. A kísérleti műveleteket az alábbi jellegzetes példán mutatjuk be. A vírus izolálása és a virális polimeráz tisztítása A vírust a már említett módon [Green és társai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385—393 (1970); Rokutanda és társai: Nature. 227, 1026 —1028 (1970)] izoláltuk és tisztítottuk egér-sarcoma-vírus (Moloney izolátum) által transzformált patkánysejtekből (78 Al sejtek) és egér-sarcoma-vírus (Harvey izolátum) által transzformált egérsejtekből (MEH sejtek). A virion-polimerázt 20—40-szeresen tisztítottuk úgy, hogy a tisztított vírust 0,5% NP—40 (nonidet P—40) (0,1 mólos nátriumkloridban 0,01 mólos trisz-ipuffer (pH = 7,6) és 0,001 mólos EDTA keverékében szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk és 15—30% szacharóz-gradiensben, 10 mmólos nátriumfoszfát-puffer (pH = 7,4), 2,5 mmólos magnéziumklorid, 10 mmólos ditiotreit és 5% glicerin keverékében 24 órán át 3í8 000 ford./perc sebességgel, Spinco SW41 rotorban zónacentrifugálásnak vetettük alá. A 22 összegyűjtött frakcióból az enzimaktivitás csúcsfrakcióit (13— 17) egyesítettük és —70°C-on 30%~os glicerinben tároltuk. A DNS-polimeráz vizsgálata Az enzim inkubációját 1 órán át 37 °C-on végeztük 100 ml, 40 mmól trisz-^puffert (pH = 8,0), 5 mmól ditiotreitet, 30 mmól nátriumkloridot, 2,5 mmól magnéziumkloridot, 0,1 mmól dATP-ot, (adenin-dezoxiribozid-trifoszfát). dGTP-ot (guanin-dezoxiribozidétrifoszfátX dCTP-ot (citidin-dezoxiribozid-trifoszfát) és 10 ,«Ci s H-dTTP-ot (12—18 Ci/mmól) tartalmazó keverékben [Green és társai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385—39/3 (1970)]. A reakciót 150 lA. 1 n perklórsav hozzáadásával fejeztük be. Borjúthymus-DNS-t (100 g) adtunk hozzá hordozóként, a radioaktív DNS-termé'ket a fent említett irodalomban foglaltak szerint kezeltük. Az endogén RNS-függő DNS-polimeráz-aktivitást 0,01% NP—40-nek a tisztított vírushoz történő hozzáadása után a vizsgálat időpontjában mértük. A tisztított virus-polimeráz DNS-polimeráz-aktivitását 2 ^g poii-d(A—T) templáttal, NP—40 nélkül mértük. Rifamicin-származékok gátló hatásainak vizsgálata 10 A rifamicin-származékokat dimetilszulfoxidban 5 mg/ml koncentrációban oldottuk és 4 °C-on tároltuk. Az endogén RNS-függő DNS-polimeráz-aktivitását úgy vizsgáltuk, hogy dimetilszulfoxiddal megfelelően hígított 2 /*1 rifamicin-15 -származékot vagy 2 ,«1 dimetilszulfoxidot (kontroll) adtunk a vizsgálandó keverékhez, mielőtt a 15—30 pg virális proteint tartalmazó szétroncsolt vírust hozzáadtuk. Az enzim inkubációját 37 °C-on 60 percig végeztük. A tisztított enzim gátló 20 hatását úgy vizsgáltuk, hogy 2 ,«1 rifamicin-származékot vagy dimetilszulfoxidot és 30 «1 enzimet (1—2 i"g protein) 37 °C-on 10 percig előinkubáltunk, majd 70 ,«1 szubsztrátum-keveréket adtunk hozzá, a keveréket tovább inkubáltuk, és 25 a fent leírtak szerint kezeltük. Reprezentatív kísérletekben a találmány szerinti vegyületek 2—100 ,"g/ml vagy ennél kisebb koncentrációban a H3 -dTTP beépülését 10%-nál kisebb értékre csökkentették, amint ezt a kont-30 rollkísérletekkel megállapítottuk. A vegyületeket tehát a legújabb biokémiai megismerések szerint az RNS-tumorvírusok által előidézett rákfejlődés mechanizmusára nyilvánvalóan gátló hatást fejtenek ki. 35 Az RNS-függő DNS-polimeráz gátló hatását ugyancsak egér leukaemia-vírus-polimerázán végzett vizsgálatokkal igazoltuk. Egér leukaemia-vírus RNS-függő DNS-polimerázát preparáltuk Triton X 100-zal szétroncsolt virionokból 40 [Gallo és társai: Nature, New Biology, 232, 141 (1971)]. Mind a Rauscher, mind a Moloney típusú vírusokat előzetesen tisztítottuk, megkötve azokat szacharóz 1.16 g/ml fajsúlygrádiensű tartományában, miután kezdeti kis sebességű cent-45 rifugálással a sejttörmeléket eltávolítottuk. A víruskészítmény végső koncentrációja 1011 részecske/ml. Templátként endogén 70S RNS-at alkalmaztunk. Azt találtuk, hogy 50 pg/ml vagy ennél kisebb koncentráció hatásosan gátolja az 50 enzimet. Hasonló eredményeket kaptunk, ha emberi eredetű tumorsejt-polimerázokat használtunk. Ebben az esetben a gátló hatást normál sejtpolimerázokon is tanulmányoztuk, hogy a szelektív hatást jellemezzük. Az (I) általános 55 képletnek megfelelő rifamicin-származékok hatását értékeltük két tisztított DNS-polimerázon, amelyeket 1. emberi normál (PHA-stimulált) vér lymphocytáiból, 2. lymphoblast sejttenyészetből 60 (normál donortól származó) és 3. emberi leukaemias vér lymphoblastjából különítettük el. Szintetikus és/vagy természetes templátokat használtunk. A következőkben ismertetjük a kísérleti eljá-65 rás egy jellegzetes példáját:
