165354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú növekedési hormon kinyerésére emberi agyalapi mirígyből

165354 7 és a felülúszót Sephadex G 75 (Pharmacia, Upsala) dextrángél oszlopra rétegezzük. Ez úgy készül, hogy 140 g Sephadex G 75-öt 0,05 mól ammónium-hidrogén-karbonát-oldatban (pH 8) duzzasztunk, majd egy 4,5 cm átmérőjű kromatografáló csőbe töltjük. Az 5 oszlop magassága 120 cm. A kromatografálást 0,05 mól ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal (pH 8) végezzük 50 ml/óra átfolyási sebesség mellett szobahőmérsékleten. Az oszlopról eluálódó oldat fehérje tartalmát átfolyó küvettás spektrofotométerrel 280 \Q nm hullámhosszon folyamatosan mérjük. Az anyagfelviteltől számított 700-900 ml eluciós térfogatok között gyűjtjük a növekedési hormont tartalmazó frakciót. Ez liofilizálva 360 mg végterméket eredményez ami 1 g agyalapi mirigyre vonatkoztatva 2,4 15 mg kitermelésnek felel meg. Biológiai aktivitása, a Wilhelmi-féle preparátummal gélelektroforézis és tibia-teszt alapján történő összevetésben, kb. 2 IU/mg. 2. példa 20 200 db acetonban gyűjtött agyalapi mirigyet kb. 100 ml acetonos gyűjtőfolyadék jelenlétében 0—4 C°-on felaprítunk késes homogenizátorral. A homogenizátumhoz további 400 ml előhűtött acetont keverünk. Ezután a felülúszót nuccson végzett szűréssel 25 eltávolítjuk. A szűrőn maradt szerv-homogenizátumot további 200 ml acetonnal átmossuk, majd elszívás alkalmazásával szárítjuk. Az acetonszáraz szervpor súlya 22 g. A szervport 300 ml etilalkohol, 200 ml víz és 10 30 ml tömény sósav elegyével 1 órán keresztül keverjük 0—4 C°-on. A szervmaradékot centrifugálással kiülepítjük és 250 ml fenti összetételű alkohol-víz-sav eleggyel keverjük 1 órán át. Centrifugálás után a felülúszókat egyesítjük. A 600 ml egyesített extrák- 35 tumhoz 6 1 acetont öntünk és a kiváló csapadékot éjszakán át 0-4 C°-on ülepítjük. A továbbiakban az 1. példa szerinti módon járunk el. A végtermékre számított kitermelés 1,8 mg/g. A termék biológiai aktivitása 25%-al alacsonyabb a standard preparátu- 40 ménál, megközelítőleg 1,5 IU/mg. 3. példa A 2. példa első bekezdésében leírtak szerint 25 g 8 acetonszáraz szervport készítünk. A továbbiakban is a 2. példa szerinti módon járunk el azzal az eltéréssel, hogy az extrakciós elegyben az etilalkoholt metilalkohollal helyettesítjük. Az acetonos kicsapás után az 1. példa leírását követjük. A gélszűréssel tisztított végtermékre számolva 2,1 mg/g a kitermelés. A végtermék két elektroforetikus komponenst tartalmaz és a tibia-teszt alapján azonos biológiai aktivitással rendelkezik mint a Wilhelmi-féle standard preparátum: 2 IU/mg. 4. példa 100 db mélyhűtött (-20 C°) agyalapi mirigyet (60 g) 150 ml aceton, 50 ml víz és 5 ml tömény sósav keverékével homogenizálunk, majd 1 órán keresztül 0-4 C°-on keverjük. A szervmaradékot kicentrifugáljuk és 70 ml aceton, 50 ml víz és 3 ml tömény sósav elegyével ismételt keveréses kivonásnak vetjük alá. Az egyesített kivonat térfogata 300 ml. 2,5 1 acetont, melyet előzőleg 0 5 C°-ra hűtöttünk, adunk hozzá és éjszakán át állni hagyjuk. A leülepedett csapadékot a továbbiakban az 1. példa szerinti módon dolgozzuk fel. A gélszűréssel tisztított végtermékre számolva 2,6 mg/g a kitermelés; biológiai aktivitása 10-15%-kal magasabb a standard preparátuménál, 2,2 IU/mg körüli érték. Szabadalmi igénypont Eljárás nagytisztaságú emberi növekedési hormon előállítására acetonos dehidrálással vagy mélyhűtéssel konzervált agyalapi mirigyből kivonás, a kivonatból kicsapás, oldás, újabb kicsapás, majd gélszűrés útján, azzal jellemezve, hogy a szerv kivonatolását 50-80 tf% acetont vagy metil- vagy etilalkoholt tartalmazó 1-3 pH-jú vizes oldattal végezzük, a kivonatból a növekedési hormont tartalmazó frakciót aceton adagolásával kicsapjuk, a csapadékot desztillált vízben oldjuk, majd a növekedési hormont az oldat pH-jának 4,8 és 5,2 közötti, előnyösen 5-ös értékre állításával újból kicsapjuk, és a gélszűrést 7,5-8,5 pH-n vizes közegben végezzük. 4 A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 75-1986 - Dabasi Nyomda, Budapest - Dabas