165340. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 2315 új antibiotikum előállítására
165340 13 14 Az antibiotikum koncentrációja mind fémkészülékben, mind rázott tenyészetben fermentálva álalában az oltást követő 2. és 6. nap között a legmagasabb. Pontosabban: a legmagasabb fermentációs értékekeket a 20 és 96 óra között mértük. 5 Az A 2315 jelű antibiotikumot extrakciós és adszorpciós módszerekkel különítjük el a tenyészléből és választjuk el más vegyületekből. Az elkülönítés első lépéseként előnyösen extrahálunk. A szűrt, lúgos pH-jú tenyészlevet előnyösen kloroformmal extrahál- 10 juk, de használhatunk más, gyakran használt oldószereket is. Az A 2315 további tisztítását adszorpciós eljárással foganatosítjuk, adszorbensként például szénport, poliamid alapú gyantákat, szilikagélt, Sephadex LH—20-at vagy Amberlite XAD polimer ad- 15 szorbenst használunk. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük. A példák a találmány oltalmi körét nem szűkítik, csak szemléltető jelleggel közöljük őket. 1. példa Az A 2315 jelű antibiotikum alőállítása rázott tenyészlében Az Actinoplanes philippinensis NRRL 5462 spóraszuszpenziójával a következő összetételű ferde-agart 25 oltjuk: Zsírmentes gyapotmagliszt 20,0 g CaC03 2,0 g Csapvíz 1,1 liter Előzőleg főzött, szárított zabliszt Finomított, szárított sörélesztőpor K2 HP0 4 Czapek ásványi oldata* Agar Desztillált víz *A Czapek oldat összetétele: 60,0 g 2,5 g 1,0 g 30 5,0 ml 25,0 g 1100,0 ml 35 A tenyészetet 30 C° hőmérsékleten, percenként 250-et forgó rázóasztalon, 72 órán át inkubáljuk. A fenti előinokulum 2 ml-ével a fentivel azonos összetételű inokulumot oltunk. Az inokulum térfogata 200 ml, a rázatást 1 literes lombikokban, 30 C° hőmérsékleten, 24 órán át, percenként 250-et forgó rázóasztalon végezzük. Az A 2315 jelű antibiotikum előállítása süllyesztett, aerob fermentációs körülmények között, fermentorban: A fentiekben ismertetett módon előállított inokulum 200 ml-ével 25 liter, az alábbiakban megadott összetételű steril főfermentációs táptalajt oltunk: Glükóz Burgonyakeményítő Melasz Oldódó hús-pepton Enzimesen hidrolizált kazein Szójaliszt MgS04 CaC03 habzásgátló (Dow Corning) Csapvíz FeS04 '7H 2 0(s ml tömény hidrogénkloridba oldva) 2,0 g KCl 100,0 g MgS04 • 7H 2 0 100,0 g Desztillált víz 1 liter végtérfogatra. 40 A táptalaj pH-ját nátriumhidroxid oldattal 6,2-ről 7,3-ra állítjuk be. Ezután 120 C° hőmérsékleten 30 percen át, 7—10 atü nyomáson sterilizáljuk az oldatot, ami után annak pH-ja 6,7-re csökken. 45 A ferde-agar-tenyészetet oltás után 30 C°-on, 10-14 napon át inkubáljuk. A fenti összetételű táptalajon a törzs általában nem spórázik, így úgy járunk el, hogy a micéliális felszínt a növekvő telepek számának növelésére oltókaccsal kapargatjuk. A ka- 50 pargatott tenyészetekre marhaszérumot töltünk, majd steril üvegbottal micélium-szuszpenziót készítünk. A szuszpenziót hat részre osztjuk és liofilizáljuk. Egy liofilezett tenyészettel 250 ml-es lombikokban 50 ml, az alábbiakban megadott összetételű steril táptalajt 55 oltunk: 1,0% 4,0% 0,5% 4,0% 0,4% 1,0% 0,3% 0,2% 0,02% 25 liter végtérfogatra Glükóz Burgonyakeményítő Szójaliszt 10,0 g 30,0 g 20,0 g 60 A táptalajt 30 percen át 120 C hőmérsékleten" 7-10 atü nyomás alatt autoklávban sterilezzük. A táptalaj pH-ja sterilezés után 6,4. A táptalajt 40 liter össztérfogatú fermentorba töltjük és oltás után 4 napon át 30 C° hőmérsékleten fermentálunk. A táptalajon percenként 12,5 liter steril levegőt buborékoltatunk át. Keverés: 400 fordulat/perc. Az A 2315 jelű antibiotikum elkülönítése Az előzőekben megadott körülmények között tenyésztett fermentlé 25 literét szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük. A szűrlet pH-ját 2 n nátriumhidroxiddal 8,5-re állítjuk be, a kapott oldatot pedig 2/3 rész kloroformmal extraháljuk. Az extraktumot csökkentett nyomáson desztillálva töményítjük, a sűrítményhez keverés közben, lassan, 20-szoros mennyiségű petrolétert (Skellysolve F) adunk. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomáson szárítjuk, amikor 3,13 g nyers antibiotikumot kapunk. A nyersterméket 100 ml etilacetátban oldjuk, az oldatot 2x100 cm méretű, bázikus alumíniumhidroxidból (M. Woelm, Eschwege, Germany) készült oszlopon kromatografáljuk. 300 ml etilacetáttal mossuk az oszlopot, majd a hatóanyagot etilacetát és etanol 19:1 arányú elegyével eluáljuk. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot kevés kloroformban oldjuk, és az oldatot 20-szoros mennyiségű petroléterhez (Skellysolve F) adjuk, amikor a hatóanyag kiválik az oldatból. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomáson szárítjuk. 1,63 g A 2315-öt kapunk. 7
