165227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szájhigiéniában használható enzimek és ilyen enzimeket tartalmazó készítmények előállítására
165227 Streptococcus mutans (SL - 1 NRRL B-5304 sz.) segítségével in vitro a dextránhoz hasonlóan ezt a poliszacharidot is elő lehetett állítani oly módon, hogy a törzset szénhidrát forrásként szacharóz tartalmú táptalajban tenyésztjük, illetőleg sejtmentes Streptococcus mutánst tartalmazó táptalajt szacharóz 5 oldattal inkubáljuk. Dextranázzal inkubálva a cariogenan minden esetben elkülöníthető volt a kísérő dextrántól. A cariogenant ezt követően ismert proteinmentesítő eljárással tovább tisztítottuk. Mindkét esetben a cariogenant a kísérő dextrántól 10 dextranáz segítségével különítettük el. A cariogenant ezt követően az ismert proteinmentesítő eljárásokkal tisztítottuk tovább. A cariogenan szerkezetét ismert eljárásokkal határoztuk meg: a parciális hidrolízist követően a 15 keletkező oligoszacharid frakciókat kvalitatíve és kvantitatíve meghatároztuk, metaperjodátos oxidációt és bórhidrogénnel való redukciót alkalmaztunk a vizsgálatok során. Ilyen módon sikerült a cariogenan szerkezetét tisztázni, amely egy 20 egyenes láncú az a- (l->3) és <*-(l->2) kötést 3:1 arányban tartalmazó glukánnak bizonyult. Cariogenant enzimatikusan hidrolizáló mikroorganizmusokat izoláltunk a levegőben levő baktériumokból, ezeket szénhidrátforrásként célszerűen 25 cariogenant tartalmazó agartáptalajon tenyésztettük, majd a keletkező tenyészeteket megfelelő hőmérsékleten, célszerűen 28—37 C°-on 1-10 napig inkubáltuk. Az aktív tenyészeteket azonos összetételű agar lemezen tenyésztettük tovább izolálás céljából. 30 Extracelluláris cariogenanáz enzimet izolálható mennyiségben oly módon állítottunk elő, hogy valamely cariogenázt termelő mikroorganizmus tenyészetet megfelelő hőmérsékleten, rendszerint 35 28—37 C°-on, táptalajt tartalmazó rázóedényben inkubaltunk mindaddig, míg a kívánt cariogenáz hatás-szintet elértük, rendszerint 72—96 óráig. Általában nincs arra szükség, hogy a cariogenanáz előállításánál szénhidrát forrásként cariogenant 4Q alkalmazzunk. Az egyik mikroorganizmus tenyésztésénél (Bacillus sp (MB-2665 NRRL B-5300 sz) azonban a találmány bemutatására cariogenant alkalmaztunk a táptalajban. A szokásos mutációs technikát alkalmazva sikerült olyan mutánst elő- 45 állítani, amelynek tenyésztéséhez nem szükséges cariogenant a táptalajhoz adni. A táptalajból olyan módon izoláljuk az enzimet, hogy a táptalajt centrifugálás vagy szűrés alkalmazásával a sejtmaradékoktól és egyéb oldhatat- 5Q lan részektől megszabadítjuk, a szűrletet 5—15-szörös, célszerűen vákuumban 10-szeres .koncentrációra töményítjük be, majd a fehérjéket ismert módon pl. szerves oldószerrel, fémkomplex képzővel, ammónium-szulfát vagy egyéb sóval való telítéssel lecsapjuk. 55 Célszerűen ismételt lecsapást alkalmazunk, továbbá a csapadékot tompító oldatban oldjuk, az oldatokat centrifuga alkalmazásával vagy szűréssel ismételten megtisztítjuk. A vizes oldatot a végső lecsapás után dializáljuk, ezt követően hűtjük vagy liofilezzük. 60 Az így kapott enzimre jellemző, hogy a vicinális OÍ—(l-*2) glukozidos kötéssel rendelkező a(l*3) glukozidos kötésre specifikus hatást fejt ki. Izoelektromos pontja 5,1. Széles optimális pH tartománya van, 6,0 pH-nál mérhető az aktivitás 55 csúcsértéke. A cariogenanáz ezekkel a jellemzőkkel az ismert poliszacharidázoktól jól elhatárolható. Az alábbi részletek a találmány szerinti új enzimnek, a cariogenanáznak előállítására és jellemzésére szolgálnak. Cariogenan izolálása humán foglerakódásból Friss foglerakódást vettünk le donoroktól, akik a lerakódás képződéséhez szükséges 4—6 nap alatt minden szájhjgiéniát mellőztek. Spatulával, az összes fogfelületről végeztük a gyűjtést. A nedves bevonatot 10 ml desztillált vízben szuszpendáltuk, majd az enzimek inaktiválása céljából 20 percig forró vízfürdőben helyeztük el. Az oldhatatlan részeket centrifuga alkalmazásával elkülönítettük, majd mintegy 2 ml vízben újra szuszpendáltuk és ezt követően fagyasztással szárítottuk. Donoronként általában 6—15 mg szárazanyag-tartalmú lerakódást lehetett ilymódon kapni. A cariogenan elkülönítése a következőképpen történt: A poliszacharidokat (10 mg) szobahőmérsékleten 30 percig tartó keveréssel 1 liter 0,5 n nátriumhidroxid oldattal oldottuk. Az oldhatatlan részeket centrifugálás alkalmazásával elkülönítettük, ezt a részt a továbbiakban nem dolgoztuk fel. A kissé opálos felülúszót 2 n ecetsav hozzáadásával 5.1 pH értékre állítottuk be. A viszkózus szuszpenzióhoz ml-enként 200 egység dextranázt adtunk. A szuszpenziót 37 C°-on inkubáltuk, amíg a dextranáz által szolubilizált antron-pozitív cukrok maximális értéket értek el. Ehhez általában 6—8 óra volt szükséges. A dextranázzal feltárt szuszpenziót, amely a kezelés után kevésbé viszkózussá válik, centrifugálásnak vetettük alá, és így a feltáratlan. anyagot elkülönítettük. A szemcsés anyagot kétszer 10 ml desztillált vízzel mostuk. 5 ml 0,5 n nátriumhidroxiddal szolubilizáltuk, majd azonos térfogatú kloroform-butanol 9:1 arányú elegyével fehérjementesítettük, kis sebességgel 15 percig keverve az elegyet. A kloroform-fehérje komplexet centrifugálás segítségével elválasztottuk. A tiszta vizes fázist leszivornyáztuk, a fehérjementesítési műveletet addig ismételtük, amíg a protein-fehérje komplex már csak a két fázis-* határfelületét részben belepő vékony réteg volt. A tiszta és csaknem színtelen vizes fázist egy éjjelen át ionmentes víz átfolyatásával dializáltuk. A lúgosság csökkenésével a cariogenan fehér, átlátszó, fényes lemezekből álló gél formájában vált ki. A gélt fagyasztással szárítva fényes könnyű port kaptunk, amely a kiindulási nyers poliszacharidok 25%-át képviseli. Cariogenan előállítása in vitro Streptococcus 4 mutans segítségével A cariogenan elkülönítésénél az alábbi összetételű táptalajt használtuk fel: 5 g élesztőkivonatot, 11 g triypticázt, 60 g szacharózt, 1 g Na2 C0 3 -ot, 0,5 ml sóoldatot (800 mg MgS04 .7H 2 0; 40 mg FeCl3 .6H 2 0; 18 mg MnCl 2 pro 100 ml ionmentes víz), 1 liter 0,1 M 7,3 pH-jú foszfát tompító oldatban oldva. A táptalajt Streptococcus mutans-sal oltottuk be (SL-1 NRRL B-5304 sz.), az oldhatatlan részt leszűrtük, amikor a táptalaj pH-ja 5,2 értékre esett le. Ezt követően centrifugálást alkalmaztunk, az anyagot 20-szoros térfogatú ionmentes vízzel mostuk, majd fagyasztással szárítottuk. 2
