164979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás benzodiazepin-származékok előállítására mikrobiológiai transzformációval

3 164979 4 eljárásokkal állíthatók elő. Ilyen eljárást közölnek például a 45-28187 számú japán közzétételi iratban. F vegyületek az (T) általános képletű vegyületekből, ahol R1

hidrogénatom, is előállíthatók, azokat R1

—OH általános képletű alkoholok aktív észterével kezelve, amely általános képletben R1

az előzőekben megadott csoportokat jelenti A találmány szerinti eljárás kivitelezésekor előnyösen használható mikroorganizmusokat a hidroxilező enzimrendszert tartalmazó organizmus szaporodását lehetővé tevő táptalajon tenyésztjük. Ilyen tenyésztő táptalajok általában felhasználható nitrogén- és szénforrásokat, és más táptalajalkatrészeket, például foszfort, ként. káliumot, nyomelemeket és olyan egyéb növekedést elősegítő faktorokat tartalmaznak, amelyek a mikroorganizmusok növekedéséhez szükségesek. Nitrogén- forrásként előnyösen szójalisztet, peptont, húskivonatot, kukoricalekvárt, aszparagint, karbamidot és ezek keverékét használhatjuk. Szén-forrásként glükózt, keményítőt, glicerint, dextrint, melaszt és ezek keverékét előnyösen használhatjuk. A tenyésztő táptalaj és a fermentációs-rendszer pH-ját előnyösen 7,0 körüli értékre állítjuk be. A tenyésztő táptalaj és a fermentációs-rendszer hőmérsékletét 20 C és 37 C° előnoysen 28 C° és 30 C° között tartjuk. A fermentációt aerob körülmények között végezzük, sőt, a jó eredmények eléréséhez keverés és levegőztetés szükséges. A fermentációt előnyösen levegőztetett fermentorban. a fent megadott összetételű vizes táptalajban végezzük. Egy. a felszerelt Streptomvces-ek közé tartozó törzzsel beoltjuk a laptalajt, majd tenyésztjük az organizmust. Az organizmus növekedésének befejeződése után vagy a növekedés kezdetekor hozzáadjuk a tenyésztő táptalajhoz az (1) általános képletű vegyületet, amely 2-8 napos fermentációs idő alatt lényegében teljes mértékben a (II) általános képletű vegyületté alakul át. A szubsztrát koncentrációja széles határok között változhat, a tenyésztő táptalaj 1 literére vonatkoztatva 5 g-ig, vagy még magasabb koncentrációig. 1 liter tenyésztő táptalajhoz előnyösen 0,5-5 g szubsztrátot adagolunk. A szubsztrátot előnyösen oldószerrel hígítva, vagy hígítás nélkül is adagolhatjuk. Előnyösen szerves oldószerben, például etanolban 5-10%-os oldatként adagoljuk. A szubsztrát érintkezésbe kerülhet a mikroorganizmusokkal és annak enzimeivel anélkül, hogy alkülönítenénk ezeket a tenyésztő táptalajtól, vagy eljárhatunk olymódon is. hogy először elkülönítjük a mikroorganizmus sejtjeit és enzimeit a táptalajtól és a szubsztráttal együtt a tenyésztő táptalajtól különböző, előnyösen használható pufferhoz adjuk. Az (I) általános képletű szubsztrátot a növekedő tenyészethez vagy az enzim-tartalmú oldathoz egyszerre, lépésenként vagy a növekedés és a reakció előrehaladtával folyamatosan adagolhatjuk. Az (I) általános képletű szubsztrát és a mikroorganizmusok vagy az enzimek jobb érintkezését a szubsztrát finom szuszpenzió formájában történő adagolásával segítjük elő. A finomeloszlású szuszpenziót ultrahangos kezeléssel állítjuk elő A mikrobiológiai átalakítás eredményeként kapott termékeket, azaz a (II) általános képletű vegyületeket 5 az ismert eljárásokkal, a termékek és a szennyezőanyagok közötti különbségeket (oldhatóság, adszorbeálhatóság. az oldószerek közötti megoszlási hányados stb.) felhasználva különítjük el a reakcióelegyből. A reakcióelegyet szerves oldószerrel. 10 például kloroformmal, széntetraklonddal, etilénkloriddal, diklórmetánnal, éterrel stb. extraháljuk, majd a szerves oldószeres fázist bepároljuk. A desztillációs maradékot, ha szükséges, különböző eljárásokkal tovább tisztítjuk, például szilika 15 gélen vagy Sephadexen végzet; oszlop- vagy vékonyrétegkromatografálás útján, savas extrakcióval és többszöri kristályosítással. •\/ (I) általános képletű benzodiazeptn származék a hidroxileződésen kívül olymódon is átalakul, 20 hogy az R' - ami különböző, már megadott csoportokat jelent, kivéve hidrogénatomot - helyen alkilcsoport hasad le a molekuláról: 25 >CH

2 ~ - >C ; ; > N-.R' >'N H "" OH Ez az eljárás szintén a találmány oltalmi koréhez tartozik. A találmány szerinti eljárással kivitelezhető ^ újtípusú átalakítás a Streptomyces nemhez tartozó mikroorganizmusok bármelyik olyan örzsével foganatosítható, amelyik hidroxilező enzimrendszerrel rendelkezik. Ilyen mikroorganizmusok többek között a következők: Streptomyces albidoflavus K ATCC 15844. Streptomyces flavus ATCC 3369. Streptomyces griseochromogenes ATCC 14511. Streptomyces roseochromogenes 1FO 3363. Streptumyces fradiae IFO 3360. Streptomyces gnseus IFO3102. Streptomyces takarazukaenzis S 3 40 FERM-P No. 943. Streptomyces calvus S -4 FERM--P No. 944., Streptomyces fimicarius S-l2 FERM -P No. 945, Streptomyces chartreusis S-19 FERM P No.' 946, Streptomyces transformand S 60 FERM -P No. 947, Streptomyces globisporus S- 120 45 FERM P No. 948, és Streptomvces benzodiazepinicusS-145 FERM-P No. 949. A hét „FERM-P" jelű törzset foldmintából izoláltuk és a fenti számon letétbe helyeztük: Fermentation Research Institute Agency of Industrial -,0 Science and Technology, China. Japán. A „FERM- P" jelű törzseket a Waksman-rendszer (Waksman: The Actinomycetes, Vol. IE 1961.) alapján határoztuk meg és neveztük el. A fenti törzsek spórákat termeinek és növekedése sukkor légmicéliumokat figyelhetünk meg, sporangiurnok nem képződnek. A vegetatív micéliumokban szeptumok nem alakulnak ki, bacillus- vagy coccus-szerű fragmentumok nem képződnek. A spórák láncot alkotnak. A ^0 fentiek alapján a „FERM—P" jelű törzsek a Streptomyces nemen belül a II családba, a Steptomycetaceae-k közé sorolhatók. A törzsek taxonómiai jellemzőit a következő táblázatokban adjuk meg. 2