164903. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására 1-hidroxi- benztriazol- származékok jelenlétében

5 164903 6 A karboxil-csoporton védőcsoportot hordozó, vizben nehezen oldódó peptidek esetében az 1-hidroxi-benztriazol adalékanyagot teljes egészében kirázhatjuk nátrium- vagy káliumhidrogénkarbonát -oldattal, vagy nátriumkarbonát-oldattal. Ennek az eljárásváltozatnak az az előnye, hogy a lúgos mosóoldatok megsavanyitásával az 1-hidroxi-benztriazol adalékanyagot kicsaphatjuk. Az N-hidroxi-szukcinimid esetében kicsapást nem végezhetünk, ugyanis az N-hidroxi-szukcinimid savakban is oldódik. Az 1-hidroxi-benztriazolt a nehezen oldódó peptidek mellől izopropanolos, alkoholos, metanolos, tetrahidrofurános vagy forró vizes extrakcióval is elkülöníthetjük. Az 1-hidroxi-benztriazol jelenlétében végzett szintézis során a peptid mindig nagyobb hozammal képződik, mint az N-hidroxi-szukcinimid adalékanyaggal, vagy anélkül végzett eljárás esetében, így például diciklohexilkarbodiimid és 1-hidroxi-benztriazol jelenlétében, Z-Phe-Phe-Pro-Pro-OH és H-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-OBu* reakciójával 91,4%-os hozammal kapjuk az antamanid szekvenciájának megfelelő védett dekapeptidet - Amanita phylloides-bői származó ciklodekapeptidet -, mig ha adalékanyagként N-hidroxi-szukcinimidet alkalmazunk, a hozam csak 61%. Az uj eljárást a kortikotropin-(l-23)-trikozapeptid-amid előállítására is alkalmazhatjuk, az 1 240 088 sz. NSZK szabadalomban leirt eljárás analógjaként. Az ismert eljárásban adalékanyagként a diciklohexil-karbodiimid mellett 4-nitrofenolt alkalmaznak. Ennél az adalékanyagnál azonban a pentaklórfenolvagyhidroxi-szukcinimid jobbnak bizonyult. Ha az utóbbi adalékanyagok jelenlétében elért hozamot 100-nak tekintjük, a különböző adalékanyagok jelenlétében elért hozamok számértéke a következő: adalékanyag nélkül = 60, 4-nitrofenollal = 80, 1-bidroxi-benztriazollál: 140. Ezeket a számadatokat a biológiai kiértékelésen kivül egy kvantitatív meghatározási módszer is alátámasztja. A kvantitatív meghatározás a Naturwiss. 42 (1955)-ben ismertetett papirkromatográfiás nyerstermék-szétválasztás analógiájára a ninhidrin-kadmium komplex szinintenzitásának fotometrikus kiértékelésén alapszik. Amint az 1. táblázatból látható, ha a szintézist diciklohexilkarbodiimid és 2 mőlekvivalens 1-hidroxi-benztriazol adalékanyag jelenlétében, tetrahidrofuránban végezzük, 1%-nál kisebb mértékű racemizáciő megy végbe. Ha oldószerként dimetilformamidot alkalmazunk, és 2 mólekvivalens helyettesitetlen 1-hidroxi-benztriazol adalékanyagot használunk fel, kismértékű racemizáció lép fel, 1-1,2 mólekvivalens mennyiségű adalékanyag jelenlétében a racemizáció mértéke 1%-nál kisebb. Az N-hidroxi-szukcinimid adalékanyag esetében forditott a sorrend. Ha a peptidet diciklohexil-karbodiimiddel és 1-hidroxi-benztriazollal aktiváljuk, 1 mőlekvivalens 1-hidroxi-benztriazol jelenlétében a legkisebb a racemizáció mértéke. Tetrahidrofurán oldószerben is 1%-nál kisebb mennyiségű racém termék képződik. Az N-hidroxi-szukcinimid adalékanyag esetében ismét forditott sorrend alakul ki (lásd 2. táblázat). A III. 2. és 3. példák szerint [BOOG1N(BZ)-OBZ szintézisé] 2 . mólekvivalens N-hidroxi-szukcinimid jelenlétében kisebb hozammai kapjuk a terméket, mint 1 mólekvivalens adalékanyag jelenlétében, és a termék erősen szennyezett. Ez azt jelenti, hogy N-hidr-5 öxi-szukcinimid jelenlétében a racemizáció viszszaszorul ugyan, de nagymennyiségű melléktermék képződik. Ha a peptideket egylépéses eljárásban állitjuk elő ugy, hogy a karboxii-vegyületeket karbodiimid-vegyület és 1-hidroxi-benztriazol-vegyUlet 10 jelenlétében reagáltatjuk az amin-vegyületekkel, a reakciót előnyösen 2 mőlekvivalens (I) általános képletü 1-hidroxi-benztriazol jelenlétében végezzük. Egyes esetekben az uj aktivált észtereket elkülöníthetjük. Az egy készülékben végzett eljárással 15 különösen előnyösen állithatunk elő szerinpeptideket, igy pl. a Z-Ser-Gly-ONB-t diciklohexil-karbodiimid és 2 mólekvivalens 1-hidroxi-benztriazol jelenlétében 97,5%-os hozammal állithatjuk elő. Ha a reakciót 1-hidroxi-benztriazol adalékanyag 20 nélkül végezzük, a terméket csak 70%-os hozammal kapjuk JHelv. Chim. Acta 42 1702 (1959)]. Az uj eljárásnak tehát elsősorban a szerinpeptidek előállításában van nagy jelentősége, ugyanis az eddig alkalmazott azid-módszerrel csak kisebb 25 hozammal állithatők elő a termékek. Az N-karbobenzoxi-szerin-azidból a megfelelő izocianáton keresztül 4-karbobenzoxi-amin-oxazolidinon-2 melléktermék is képződik. Ha a fenti vegyületet diciklohexil-karbodiimid jelenlétében állitjuk elő, 30 melléktermékként N-acil-karbamidot kapunk \E. Schröder és K. Lübke: The Peptides I. kötet, Academic Press, New York és London (1965), 208. oldal]. A glutaminil- vagy aszparaginilpeptidek diciklo-35 hexilkarbodiimid jelenlétében végzett előállítása során a savamid-csoportok dehidratizálódása következtében jelentős mennyiségű nitrilvegyület képződik. Az N-acil-aszparagin-vegyületek esetében imidkötés is kialakulhat. Ennek megfelelően az 40 aszparaginilpeptideket csak 39-45%-os hozammal tudták előállitani ÍE. Schroder és K. Lübke: The Peptides, I. kötet, Academic' Press, New York és London (1965), 191 és 202-204. oldalak]. Ha a reakciót diciklohexil-karbodiimid és 1-hidroxi-benz-45 triazol jelenlétében végezzük, gyors reakcióban és jó hozammal kapunk tiszta glutaminil- és aszparaginil-peptideket. A találmány szerinti eljárással például a Z-Asn-Leu-OCH3"t 85%-os és a Z-Gln-Ala-OBu'-t 73,7%-os hozammal állithatjuk 50 elő. A találmány szerinti eljárással az ismertnél jobb hozammal állithatjuk elő a protonos guanidocsoportot tartalmazó argininpeptideket is. Az ismert eljárásokkal előállithatónál tisztább terméket 55 kapunk. Előállíthatjuk továbbá protonos N-acil-argininből és 1-hidroxi-benztriazolból a megfelelő aktivált észtert is, amelyet elkülönités nélkül tovább reagáltatunk. A találmány szerinti eljárással előállítandó pep-60 tidek építőköveiként valamennyi, a természetben található peptideknek megfelelő, L vagy D-aminosavat felhasználhatjuk. Az eljárást továbbá /3-aminosavakkal, például /3-alaninnal, vagy egyéb, csak szintetikus vagy félszintetikus utón előállítható 65 aminosavakkal, például oC-metilalaninnal, oC-me-3