164533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tuberaktinomicin-N antibiotikum előállítására

13 164533 14 A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik: 1. példa: Erlenmeyer-lombikokba 100 ml 6,0 pH-értékű, 3% glükózt, 2% keményítőt, 3% szójalisztet és 1,5% nátrium-kloridot tartalmazó tápközeget vittünk be és 30 percig "sterilizáltuk 120G hőmérsékleten. A sterilizált tápközeget azután a 1Q Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus N6 130 törzs oly kultúrájával oltottuk be, és 2,5 cm lökető, percenként 330 fordulattal üzemeltetett rázóasztalon, 30 C° hőmérsékleten lefolytatott 7 napi inkubáltatás útján fermentáltuk. A 15 lombikok tartalmát egyesítve 1,5 liter fermentlevet kaptunk, amely 2360 7/ml tuberaktinomicin-N antibiotikumot tartalmazott. A micéliumot és egyéb szilárd anyagokat kiszűrjük és a szűrletet egy 2,5 cm átmérőjű, 2

n 28 cm hosszú, 150 ml ioncserélő gyantával (Amberlite IRC-50, a Rohm and Haas cég gyártmánya) töltött oszlopon vezetjük keresztül, percenként 2,5 ml átáramoltatási sebességgel, a hatóanyag adszorbeáltatása céljából. Az oszlopot 2

5 azután vízzel mossuk, majd az antibiotikumot percenként 1,3 ml sebességgel átáramoltatott 0,5 n sósavoldattal eluáljuk az oszlopról. Az eluátumot 10 ml-es frakciókban fogjuk fel, a hatóanyagot a 45—63. frakció tartalmazza, ami az eluátum-frak- 30 ciók ibolyántúli adszorpciós színképe és biológiai vizsgálat alapján állapítható meg. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, az így kapott körülbelül 200 ml folyadékot nátrium-hidroxidoldattal semlegesítjük és vákuum- 35 ban 15 ml térfogatra betöményítjük. A koncentrátumból a szervetlen sókat kiszűrjük, a szűrletet aktívszénnel derítjük, majd 150 ml metanolt adunk hozzá, éjjelen át 5CC hőmérsékleten állni hagyjuk, azután a levált csapadékot szűréssel 40 elkülönítjük és vákuumban megszárítjuk. Ily módon 3,07 g nyers tuberaktinomicin-N-hidrokloridot kapunk, amelynek tisztasága 75,5%. Hozam: 62%. 2. példa: 45 3% glükózt, 2% keményítőt és 1,5% nátrium-kloridot tartalmazó tápközeget készítünk és ennek pH-értékét 6,0-ra állítjuk be. Ebben a tápközegben Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus N6 130 mikroorganiumust tenyésztünk az 1. példában leírt módon és a kapott fermentlevet ugyancsak az 1. példában leírt módon dolgozzuk fel. Ily módon 1,5 liter fermentlevet kapunk, amely 2150 7/ml tuberakti- 55 nomicin-N antibiotikumot tartalmaz. A fermentációs lé leírt módon történő feldolgozásának eredményeként 2,98 g nyers tuberaktinomicin-N-hidrokloridot kapunk, amelynek tisztasága 70,5%. Hozam: 65%. 3. példa: 2% glükózt, 3% keményítőt, 1,4% száraz élesztőt és 0,5% nátrium-kloridot tartalmazó 65 tápközeget készítünk az 1. példában leirt módon. A továbbiakban az 1. példa szerint járunk el, és így 1 liter fermentlevet kapunk, amely 1665 7/ml tuberaktinomicin-N antibiotikumot tartalmaz. A fermentlének az 1. példában leírt módon történő feldolgozása útján 1,55 g nyers tuberaktinomicin-N-hidrokloridot kapunk, amelynek tisztasága 72%. Hozam: 67%. 4. példa: 100 ml tápközeget készítünk, amely 1% keményítőt, 1% melaszt, 1% peptont, 1% húskivonatot és 0,5% nátrium-kloridot tartalmaz, a tápközeg pH-értékét 7,0-ra állítjuk be. Ezt a tápközeget 500 ml-es Sakaguchi-lombikban 120 C° hőmérsékleten 30 percig sterilizáljuk, majd Streptomyces giseoverticillatus var. tuberacticus N6 130 mikroorganiumussal oltjuk be, 7 cm löketű rázóasztalon, percenként 130 lökettel rázatjuk és ilyen körülmények között 2 napig inkubáltatjuk 30 C° hőmérsékleten. Az így kapott kultúrával 20 liter oly steril tápközeget oltunk be, amely 1% keményítőt, 1% melaszt, 1% peptont, 1% húskivonatot és 0,5% nátrium-kloridot, továbbá 5 ml folyékony habzásgátlószert (UNIOL D-2000, a Nissan Yushi K.K. tokiói cég gyártmánya) tartalmaz. Ezt a tápközeget beoltás előtt egy 30 Uteres fermentorba visszük és 120 Cc hőmérsékleten 30 percig sterilizáljuk. Beoltás után a fermentációt 24 óra hosszat folytatjuk 30 C° hőmérsékleten, miközben a fermentort percenként 200 fordulattal keverjük és percenként 20 liter levegővel levegőztetjük. (A bevezetett levegőt előzőleg sterilizáljuk.) A fenti módon kapott fermentlevet azután egy 3% keményítőt, 2% glükózt, 1,5% melaszt, 1,5% szójalisztet, 0,5% nátrium-kloridot és 100 ml fenti habzásgátlószert tartalmazó, 170 liter térfogatú tápközeghez adjuk és ezt az elegyet egy rozsdamentes acélból készített és előzőleg sterilizált fermentorban 90 óra hosszat keverjük 30 C° hőmérsékleten, percenként 300 fordulattal, miközben percenként 100 liter levegőt vezetünk a fermentációs lébe. Ily módon 190 liter fermentlevet kapunk, amelyenk antibiotikum-tartalma 2400 7/ml. Ezt a fermentlevet sósavval 2,0 pH-értékre állítjuk be, majd 2,5% kovaföldet adunk hozzá és leszűrjük. A kapott, körülbelül 160 liter térfogatú szűrletet nátrium-hidroxidoldat hozzáadása útján semlegesítjük és egy 10 liter Amberlite IRC—50 ioncserélő gyantát tartalmazó oszlopra visszük, óránként 20 liter átáramoltatási sebességgel. Az oszlopot azután vízzel mossuk és a gyantán adszorbeált tuberaktinomicin-N antibiotikumot n sósavoldattal eluáljuk, óránként 5 liter átáramoltatási sebességgel. Az eluátumot 1,5 literes frakciókban fogjuk fel, a 10—17. frakció tartalmazza a tuberaktinomicin-N hatóanyagot. Ezeket a frakciókat egyesítjük, nátrium-hidroxidoldattal semlegesítjük és körülbelül 1300 ml térfogatra betöményítjük. Az ennek során kivált nátrium-kloridot kiszűrjük, a szűrletet aktívszénnel derít-7