164498. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoprotein előállítására
164498 9 10 dik csúcs a /?-globulin-szerű elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező anyagnak felel meg. A három frakciót külön-külön desztillált vízzel 5 szfemben dializáljuk, majd a dializáit frakciókat betöményítjük és fagyasztva szárítjuk. •Hisztaminopexiás aktivitással csak az első frakció rendelkezik. A szennyezett amid cellulózacetáton, pH =* 8,6 értéken végzett elektrofo-10 rézis alapján prealbumin-szerű elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező fehérjének bizonyúlt. A még jelenlevő szennyezéseket G200 Sephadex gélen végzett kromatografálással távolítjuk el. A fenti kezelés után a minta aktivitása 15 nagyimértékiben megnövekszik. azonban az anyag károsodásának veszélye nélkül még 24 órával meghosszabbíthatjuk. Ezután a koncentrált zónákat egyenletes teljesítményű, perisztaltikusán működő szivattyú segítségével elkülönítjük, eközben az oszlopba LBK Pérpex szivattyúval az eltávolított oldattérfogattal azonos térfogatú desztillált vizét juttatunk. Az eluátumok optikai sűrűségét 280 nm és 250 nm hullámhosszon meghatározzuk, majd megmérjük az egyes eluátumfrakciók pH-értékét az egyes csövekben lezajlott migráció hőmérsékletével azonos hőmérsékleten. Az egyes frakciókat az optikai sűrűség és a pH-érték alapján különítjük el egymástóL Az eluátumot ezután az aimfolinok és a szacharóz elválasztása érdekében G25 vagy G50 Sephadex gélen bocsátjuk keresztül. Egyetlen olyan eluátumfrabeiót kapunk, .amely izolált tengerimalac^iléumön csökken'tiahisztamin izommerevítő hatását. Ez a frakció az elektromos koncentrálás során pH = 4,0 ±0,1 értéken dúsul fel. A kapott eluátumot fagyasztva szárítjuk. Az elektromos koncentrálás során kapott eluátumfrakciók 280 nm hullámhosszon felvett optikai sűrűség-görbéjében három csúcs jelenik meg. Az egyes frakciók Ve /Vo értéke pontosan megfelel az emberi vérszérum kromatögrafálasával elkülönített frakciókéinak. Az eluátumokban jelenlevő anyagok jellegét elektroforetikus és immunoelektroforetikus vizsgálatókkal határozzuk meg. Hisztaminopexiás hatást csak a második csúcsnak megfelelő eluátumfrakció mutat (a frakció Ve /Vo értéke 1,40 és 1,70 közé esik), ez az eluátumfrakció azonban még heterogén összetételű. A tiszta fehérje Ve/Vo értéke 1,30 és 1,58 közé esik. A szennyezett amidban albumin-szerű elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező anyag, jelentős mennyiségű a2-globulin-szerű elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező anyag, továbbá nyomnyi mennyiségű immunoglobulin található. A biológiai vizsgálatok alapján 0,3 ßg fenti módon előállított porszerű anyag hatása felel meg 1 hisztaminopexiás egységnek. Zónaelektroforézissel Végzett elválasztás, sűrűséggradiens fenntartásával Az előzőekben kapott aktív minta fehérjeanyagait LKB 3340C készülékben, folyadékaramban végzett zónaelektroforézissel választjuk el. Az egyes fehérjéket sűrűséggradiens fenntartásával tartjük migrációs zónáikban. 150 mg, a fenti módon előállított fehérje-frakciót 3 ml barbitursav-pufferoldatban oldunk. Az elektroforézist 20 órán át végezzük; eközben 530 V feszültségkülönbséget tartunk fenn, és 22 mA erősségű áramot alkalmazunk. 280 nm hullámhosszon meghatározzuk az eluátum optikai sűrűségét. Az optikai sűrűség-görbében három csúcs jelenik meg. Az első csúcs a prealbumin-szerű elektroforetikus mozgékonya sággal, a második csúcs az a2-globulin-szerű elektroforetikus mozgékonysággal, míg a harma-Elektromos koncentrálás Az izoelektromós elválasztást pH = 3,0-tól pH = 5,0-ig terjedő pH-gradiens beállítására alkalmas amfolin-elegyben végezzük. Az elválasztáshoz LKB 8101 készüléket használunk fel. 20 mg, a fenti módon előállított I. frakciót 3 ml desztillált vízben oldunk. Az oldatot 24 órán át dializáljuk, majd a kapott oldatot a készülékbe helyezzük, és 72 órán át 1 mA erősségű áram hatásának tesszük ki. Az elektródok között 300 V fészültségkülönbséget biztosítunk. Az eluátumot szivattyúval elválasztjuk, és 280 nm hullámhosszon megmérjük optikai sűrűségét. 1 mg így kapott termék hisztaminopexiás aktivitása 5.105 egységnek felel meg. A fenti módon kapott frakció elektroforetikus mozgékonysága elektroforézis és immunoelektroforézis alapján a prealbuminokénak felel meg. A kapott termék aktivitása további elektromos koncentrálással már nem fokozható. 2. példa Hisztaminopexiás hatású glükoprotein elkülönítése sertés-szérumfehérjékből Sertés-vérszérum-elegyet pH ^ 2,10 értékű fitinsav-oldattal kezelünk. A csapadékot centrifu-45 gálással elkülönítjük, majd a fölyadékréteget desztillált vízzel szemben dializáljuk, betöményítjük, és a kivonatot fagyasztva szárítjuk. A fitinsavas kivonatot ezután kromatográfiás úton frakcionáljuk. 50 A sértés-vérszérum fehérje-komponenseit molekulasúlyuk alapján különítjük el egymástól. A fehérje^elegyet G200 Sephadex gélen kromatografáljuk. 2 m magas, 5 cm átmérőjű oszlopot G200 Sephadex géllel töltünk meg, és az oszlo-55 pot 0,1 mól trlsz-t és 1 mól nátriUm'klöridot tartalmazó, pH = 8 értékre beállított püfferoldattal itatjuk át. Az oszlopon 100 ml sertésszérumot bocsátunk átJ Az eluátumot frakciókba gyűjtjük. Az egyes 60 frakciók pH-értékét meghatározzuk, majd a frakciókat a pH-érték és az optikai sűrűség-görbe alapján 4 főfrakeióvá egyesítjük. Az egyes frakciókat dializáljuk, betöményítjük, majd fagyasztva szárítjuk. A kapott termékeket farnla-65 kológiai vizsgálatnak vetjük alá. 10 lö 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
