164498. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoprotein előállítására

164498 5 6 A találmány szerinti eljárással előállított hisztaminopexiás hatasuT glükoproteint bőrallergiák (pl. akut vagy krónikus csalánkiütés, hidegre-melegre való túlérzékenység, dermográfia, polimorf eritémia, eíkcéma vagy allergiás bőrpír) és általános allergiák (például asztma, göcsös hurut, allergiás nátha, allergiás kötőhártyagyulladás és elszarusodás, gyógyszerallergia, penicillin-túlérzékenység, Quincke-ödéma, szennyezett étel fogyasztása következtében fellépő hisztamin- vagy biológiai amin-mérgezés, anafilaxiás sokk hatására beálló keringési zavarok, allergiás migrén, allergiás eredetű gyomorhurut, hasmenés és bélhurut) kezelésére alkalmazhatjuk. A fentieken kívül a hisztaminopexiás hatású glükoproteint a biológiai eredetű aminokat megkötő képessége alapján a vér katecholamin-fölöslegének vagy -hiányának következtében fellépő keringési rendellenességek kezelésére is használhatjuk. A találmány tárgya tehát eljárás állati vagy emberi eredetű, a prealbuminokénak megfelelő elekt-roforetikus mozgékonyságú, fitinsavban oldódó hisztatminopexiás hatású glükoprotein előállítására, amelynek során az állati eredetű szérumfehérjéket fitinsavval végzett szelektív kicsapásnak vetjük alá, a felső folyadékréteget elválasztjuk, a fitinsav-oldatból elkülönített száraz maradékot gyengén térhálósított, polimerizált dextrángélen kromatografáljuk és a nyers aktív frakciót összegyűjtjük, vagy az emberi szérumfehérjékét gyengén térhálósított, polimerizált dextrángélen kromatografáljuk és a nyers aktív frakciót összegyűjtjük, azzal jellemezve, hogy a nyers aktív frakciót sűrűséggradiens fenntartásával zónaelektroforetikus elválasztásnak vetjük alá, a prealbuminokénak megfelelő elektroforetikus mozgékonyságú frakciót elkülönítjük, ez utóbbi frakciót zónaelektrofarézissel újabb elválasztásnak vetjük alá, a PH 3,8 és 4,2 közötti izoelektromos ponttal rendelkező frakciót elkülönítjük, és kívánt esetben az így kapott frakciót tovább tisztítjuk. Hisztaminopexiás hatással kizárólag az említett aktív frakciók rendelkeznek, a további frakciók hatástalanok. Előnyösen a következőképpen járunk el: a) a zónaelektroforézist folyadékáramban, vagy szilárd hordozó jelenlétében hajtjuk végre, b) az elektromos koncentrálást (újabb zónaelektroforézist) 500—700 V potenciálkülönbséggel, 1—8 mA áramerősséggel végezzük. A kapott frakció tisztítására nincs mindig szükség; egyes célokra kevésbé tiszta frakciók is felhasználhatók. Kívánt esetben azonban a fenti eljárásban kapott frakciót dializis^szűréssel, majd ezután karboximetilcellulóz-gélen végzett kromatográfiával tisztíthatjuk. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül a következő példákban részletesen ismertetjük. 1. példa: Hisztamonipexiás hatású glükoprotein előállítása emberi szérumfehérjékből. A. lépés: Zónaelektroforézis sűrűséggradien« fenntartásával. A zónaelektroforézist LKB 3340 típusú készülékben végezzük. A migrációs oszlopot 15 C°-ra 5 felfűtött termosztátba merítjük. Az oszlop felső része a katódtérrel, míg az oszlop alsó része az anódtérrel érintkezik, A közeg sűrűségét szakaszosan változtathatjuk úgy, hogy csökkenő sűrűségű oldatokat rétegezünk egymás fölé; vagy fo-10 lyamatos sűrűségcsökkenést biztosíthatunk úgy, hogy az egymásutáni szakaszokban fokozatosan változtatjuk az oldat koncentrációját. Előnyösen a következő összetételű oldatokat alkalmazzuk: kis sűrűségű oldatként (Rí reagens) 3 g/l kon-15 centrációjú, 8,2 pH-értékű nátrium-dietil-barbiturát pufferoldatot, míg nagysűrűségű oldatként 500 g/l koncentrációjú szacharóz-oldatot (BQ reagens) használunk. Az Rí reagens mennyisége 175 ml, míg az R^ reagens mennyisége 300 20 ml. A készülékbe 300 ml oldat-elegyet töltünk, majd az áramlást leállítjuk. Egyenes, meredek emelkedésű sűrűség-gradiens áll be. Az első edény („A" edény) 50 ml Rí reagenst 25 tartalmaz. Az oldat térfogatát az „A" edényben állandó értéken tartjuk. A „B" és „C" lombikot állandó szinten tartjuk. Az első csatlakozó tartályba >(„B" edény) 200 ml szacharóz-oldatot töltünk (R3 reagens; koncentráció: 200 g sza-30 charóz/lOOO ml Rí pufferoldat). A második csatlakozó tartályba i(„C" edény) 100 ml szacharózoldatot töltünk (R4 reagens; koncentráció: 600 g szacharóz/1000 ml Rí pufferoldat). A második csatlakozó tartályba egy leszálló cső merül be. 35 Az Rí pufferoldat a csőben a „B" edény folyadékszintjének megfelelő szintig emelkedik;. Az elegy első harmadának átvezetése alatt a „C" edénybe merülő csőben a folyadék szintje a ,,B" 40 edényben levő folyadék szintcsökkenésének megfelelő mértékben csökken. A nagysűrűségű folyadék beáramlásának mértéke elhanyagolhatóan csekély. Amikor a cső a „B" edényben levő folyadék szintváltozásának következtében ki-45 ürül, az R4 puffer kiszorított térfogata sokkal jelentősebbé válik. Így a sűrűség-gradiens meredeksége állandó értéken tartható. Az elektrofórézishez 200 mg anyagból álló mintát használunk fel. Az elektroforetikus elvá-50 lasztás előtt a mintát legföljebb 5 mlRi pufferoldatban oldjuk, és 24 órán át Rí pufferoldattal szemben dializálju'ki Az elektroforézis megindítása előtt a mintát tartalmazó oldat sűrűségét a beadagolás helyén 55 levő folyadék sűrűségével azonos értékre állítjuk be. A készülék felső részéből meghatározott térfogatú oldatmintát veszünk, és az oldatminta sűrűségét összehasonlítjuk a kezelendő minta sűrűségével. Ha a vizsgálandó oldat sűrűsége 60 nem elég nagy érték, az oldat sűrűséget szaccharóz vagy nagysűrűségű oldat hozzáadásával a kívánt értékre növeljük. Az elválasztást 550 V feszültségkülönbséggel, 18 mA erősségű árammal 16 órán át végezzük. 65 Az eluátumot szabályos időközönként távolít-3