164378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális eredetű enzimfehérjék kinyerésére fermentlevekből, szelektív frakcionált dúsítással

164378 arányban a kinyert enzimfehérje hozama, tekintettel arra, hogy az 70—80°/o körül van. Az említett eljárások hátránya tehát összefoglalva abban rejlik, hogy anyagigényességük valamint munkaigényességük mellett kismértékben hatékonyak, mert a végső termék hozama viszonylag alacsony, .annak a következménye, hogy a tisztítási folyamatok sok lépésből állnak. A találmány célja bakteriális eredetű enzimfehérjék f er mentléből való kinyerésére szolgáló olyan szelektív frakcionált dúsítási eljárás kidolgozása, amely a nagy fajlagos aktivitású tiszta enzimfehérje előállítását az eljárás lényegéből fakadóan egy lépésben, az eddig ismert eljárásoknál jobb kitermeléssel valósítja meg, vagyis olyan szelektív elválasztási mód biztosítása, amely a fermentleben levő viszonylag kevés aktív enzimfehérjét szelektíve elkülöníti a kísérőanyagoktól és egyben megoldja a bakteriális eredetű fermentlevek szűrési nehézségeit is. Ismeretes, hogy az ionos felületaktív szerek is alkalmasak egy-egy enzimfehérje szelektív dúsítására, azonban emellett erős fehérje denaturáló hatással is rendelkeznek (26051/39. sz. japán szabadalmi leírás). Az anionos és kationos felületaktív anyagok elektrosztatikus kapcsolatot létesítenek a fehérje töltéshordozó részével és így a peptidlánc fokozatosan feloldódik, miközben a protein denaturálódik. Viszonylag kis mennyiségben adagolva a felületaktív anyagot, sztöchiometrikus kapcsolat jön létre, különösen abban a pH tartományban, amelyben a fehérje és a felületaktív anyag ellentétes töltést hordoz. A fehérjefelületaktív komplex többnyire csapadék formájában kiválik. A bakteriális eredetű enzimfehérjéknek fermentlevekből való kinyerésére irányuló kísérleteink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy a baktériumok által termelt exo-enzimek nyers fermentlevének természetes vagy mesterséges cserző anyagokkal, vagy szervetlen sókkal való közvetlen kezelése és a keletkezett hasznos enzimfehérjiéket tartalmazó csapadéknak egy másik gyártási tétel azonos vagy fele térfogatú fermentlevéhez való hozzáadása után és az enzim beoldódása után a fermentleben jelenlevő hasznos enzimfehérjék mellől — a műveleti paramétereknek (pH, hőmérséklet és ionerősség) állandó értéken tartása emellett — ionos felületaktív anyagoknak a hozzáadásával az egyéb kísérő szennyeződések oldhatósága oly nagy mértékben differenciálható, hogy azok eltávolítása után kapott tiszta oldatból az ismert enzim kinyerési eljárások bármelyikének alkalmazásával e szelektív frakcionált dúsítás révén nagy fajlagos aktivitású tiszta enzimfehérje nyerhető. Kísérleteink alapján megállapítottuk, hogy a legcélszerűbb és leggazdaságosalbb a természetes cserzőanyagok közül a tannint alkalmazni, enzimfehérjétől függően 0,3—1,0% mennyiségben. Az enzim felületén megkötött cserzőanyag mennyisége pontosan nem isimert, tekintettel arra, hogy több komponensű fehérjerendszerről van szó. így kísérletileg határozzák meg a bevitt optimális tannin koncentrációt, pl. a 7838/ 5 /41. sz. japán szabadalmi leírás szerint ez 0,3— 1,5% között van. Az „első" fermentléből csak az oldhatatlan tanniin-enzim komplex kerül tovább, amelyből a „második" fermentlé pufferolt rendszerében csak az enzim oldódik be, és a tannin 10 kiszűrődik a szennyező anyagokkal együtt. A találmány szerinti eljárással kinyert enzimfehérjék tisztítását ionos felületaktív szernek optimális mennyiségiben történő hozzáadásával érjük el. Tehát ezeket éppen olyan konoentrá-15

cióban alkalmazzuk, hogy az enzimfehérje ne denaturálódjék, de le se váljon, hanem csak a kísérő szennyezések, egyéb társfehérjék oldékonysága változzék meg úgy, hogy azok eltávolíthatók legyenek az oldatból. Ionos felület-20 aktív anyagként alkil-, vagy aril-kvaterner-ammónium vegyületeket és alkil-piridinium-halogenideket alkalmazunk 0,05—0,2% koncentrációban. Ezek közül a proteázra és a renninre legmegfelelőbbnek az alkilpiridium-halogenideket 25 (pl. Sterogenol) találtuk. A baktériumok által termelt enzimek (proteáz, rennin) nyers fermentlevének tanninnal, ammóniumszulfáttal való kezelése után a csapadékot a fermentlétől elválasztjuk, és a nyers enzimet tartalmazó szi-30 lárd részt a következő fermentáció megfelelően pufferolt azonos, vagy fele térfogatú fermentlevébe belekeverjük. Az illető enzim a pufferolt körülmények között kioldódik, csapadékban hagyva a nem kívánatos kísérőket. Ugyanakkor a második fermentáció szennyező anyagait és az első fermentáció visszaoldott kísérő anyagait ionos felületaktív szeres kicsapással a fermentlében leválasztjuk. A csapadékban maradó szennyező anyagoktól a tisztább, dúsabb enzimet tartalmazó leveket szűréssel, vagy centrifugálással elválasztjuk. Így a szűrtlé hasznos enzimfehérje két-háromszorosára dúsul, a beadási térfogattól és az enzim aktivitásaitól függően, ugyanakkor a kísérő szennyező anyagok menynyisége jelentősen csökken. Az ily módon dúsított éles szeparált vagy szűrt levet bármelyik enzimkinyerési eljárással (bepárlás utáni kisózással, szerves oldószeres kicsapással porlasztva vagy fagyasztva történő szárítással stb.) feldolgozhatjuk. Az eljárás előnyeként említjük meg, hogy a tanninos feldolgozást alkalmazhatjuk annak két vagy többlépéses enzim kinyerése nélkül. Továbbá az ionos felületaktív szerek — különösen az alkil-piridmium-halogenidek (pl. Sterogenol) — adalékanyag nélkül is tükrös éles levet biztosítanak a fermentlé szeparálásánál, ugyanakkor a fermentlé tartósítására, színtelenítésére is alkalmasak. Az irodalmi adatok szerint az alkil-piridinium-halogenidek a proteolitikus enzimekkel együtt fokozottan antibakteriális hatásúak [R. D. Smyth. R, Brennan: Enzimologia 34 (2), 129— 37, (1968)]. így a fermentlé csíraszámának csökkentéséhez is hozzájárulnak, amelynek a szűrt 65 fermentlé bepárolt lé formában történő felhasz-40 60 2