164156. lajstromszámú szabadalom • Eljárás YA-56 antibiotikum előállítására

15 164156 16 Mikroorganizmus Neisseria gonorrhoeae Yoshioka Bacillus subtilis PCC-219 Escherichia coli NIHJ Jc—2 Shigella flexneri 2a Salmonella typhi T—58 Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa - Mycobacterium tuberculosis H3 7

Rv Megjegyzés: 15 I. = szívinfúziós agar-közeg II. = szívinfúziós agar-közeg +10% lószérum III. = Kirchner-közeg 20 Umezawa: Index of Antibiotics from Actinomycetes (University Park Press, Pennsylvania, USA) c. szakkönyve alapján az YA 56, YA 56—X és YA 56-Y antibiotikumok a fleomicinnel [1965/1961 és 10697/1961 sz. japán 25 közzétételi iratok] és a bleomicinnel [8117/1965 sz. japán közzétételi irat] azonos csoportba tartoznak. Az idézett japán közzétételi iratok szerint az ismert antibiotikumokat Streptomyces verticülus (hurkos légmicéliumokat képező Actinomy- 30 ceta) fermentációjábal állítják elő, és az antibiotikumokat a fermentléből több hatóanyag elegye formájában különítik el. Az YA 56, YA 56—X és YA 56—Y antibiotikumokat a fenti, ismert antibiotikumokkal összehasonlítva kitűnik, hogy az új 35 antibiotikumok biológiai hatásuk tekintetében a bleomicinnel, míg fizikai-kémiai sajátságaik tekintetében a fieomicinnel sok rokon vonást mutatnak. Az Umezawa-szakkönyv szerint a bleomicin egyik alkotóelemeként treonint tartalmaz. Ennek 40 megfelelően az YA 56, YA 56-X és YA 56-Y antibiotikumokat a bleomicintől az különbözteti meg, hogy hidrolizátumukban nem mutatható ki treonin. A fleomicin kémiai szerkezetére vonatkozóan 45 részletes vizsgálatokat tudomásunk szerint még nem végeztek, így e hatóanyag pontos szerkezete nem ismert. Megállapítottuk azonban, hogy a találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumok fizikai-kémiai szempontból a követke- 50 zőkben térnek el a fleomicintől: A fleomicin negatív Molisch reakciót ad [Journal of Antibiotics 12, 285-289 (1950), 17, 194-199 (1964)] ezzel szemben az YA 56, YA 56-X és YA 56-Y antibiotikumok pozitív Molisch reak- 55 ciót adnak. A fleomicin papirkromatográfiás elemzés során (eluálószer: 10%-os vizes ammóniumklorid-oldat) Rf = 0,55-0,70 értéknél jelenik meg, vagy 2-6 db, 0,81 -nél kisebb Rf-értékű foltot ad, ezzel szemben az YA 56-X antibiotikum 60 hasonló körülmények között Rf = 0,93 értéknél mutatható ki. Az YA 56-Y antibiotikum Rf-értéke a fenti körülmények között hasonló a fleomicinéhez az YA 56-Y antibiotikum papirkromatogramja azonban 15:10:3:12 arányú n-bu- 65 Minimális gátló koncentráció mcg/ml «•^g YA 56-X YA 56-Y II 1,56 0,78 I 0,19 0,04 I 0,39 12,5 I 0,19 3,12 I >25 3,12 I 0,39 >25 I 0,39 1,56 I 12,5 25 III 0,39 0,19 tanol - piridin — ecetsav - víz eleggyel végzett futtatás esetén eltér a fleomicinétől. Az utóbbi körülmények között ugyanis az YA 56—Y antibiotikum Rf = értéknél, míg a fleomicin Rf = 0,37 értéknél jelenik meg. A fentiek alapján az YA 56, YA 56-X és YA 56—Y antibiotikumok a bleomicintől és fleomicintől egyaránt eltérnek. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban ismertetjük. A minták aktivitását korong-módszerrel, Bacillus subtilis vagy Escherichia coli vizsgálati mikroorganizmus felhasználásával határoztuk meg. A tiszta YA 56-Y antibiotikum hidrokloridjának aktivitása, ill. a tiszta YA 56-Y antibiotikum aktivitása Escherichia coli vizsgálati mikroorganizmus jelenlétében 1000mcg/mg, ül. 4mcg/mg, míg Bacillus subtilis vizsgálati mikroorganizmus jelenlétében 950mcg/mg, ill. 1000mcg/mg. 1. példa Fermentáció 500 ml-es rázólombikba 3,0% keményítőt, 4„0% gyapotmaglisztet, 0,2% élesztőkivonatot, 0,5% nátriumkloridot, 0,3% kalciumkarbonátot és 0,002% réz(II)szulfátot tartalmazó 100 ml vizes táptalajt töltünk. A táptalajt sterilizáljuk, majd aszeptikus körülmények között Streptomyces sp. MCRL 0387 törzzsel oltjuk be. A közeget 48 órán át 27 C°-on rázás közben tenyésztjük. 30 Uteres fermentorba 15 liter, a fenti összetételnek megfelelő vizes táptalajt töltünk, és a táptalajt atmoszférikusnál nagyobb nyomáson, 120C°-on 20 percig sterilizáljuk. Az így kapott táptalajt aszeptikus körülmények között 0,1 Üter, az előző lépésben kapott közeggel oltjuk be. A közeget levegőztetés és keverés közben 48 órán át 27 C°-on tenyésztjük. A fenti eljárással 15 liter oltótenyészetet kapunk. 2000 literes fermentorba 10% maláta-dextrint, 2,0% gyapotmaglisztet, 0,3% kalciumkarbonátot, 0,5% nátriumklöfMot és 0,002% réz(II)szulfátot tartalmazó 1500 liter vizes táptalajt töltünk. A táptalajt atmoszférikusnál nagyobb nyomáson 120C°-on 20 percig sterilizáljuk. A táptalajt lehűtjük, aszeptikus körülmények között 15 liter, a fenti módon előállított oltótenyészettel oltjuk be, majd az elegyet 165 órán át tenyésztjük. A 8