164116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentációs úton nyert nyers peptid-alkaloidbázisok tisztítására
7 164116 8 eleggyel addig végezzük, míg az eluátum színe vörösből sárga színbe megy át és van Urk színreakcióval vizsgálva alkaloidot már nem tartalmaz. Az így nyert kb. 30 liter térfogatú szines eluátumhoz annyi 1%-os vizes borkősav oldatot adunk, míg stabilan 2 fázis alakul ki, és a fázisokat elválasztjuk. A felső, etilacetátos fázist van Urk színreakcióval alkaloidra vizsgáljuk. Pozitív reakció esetén az etilacetátos fázist további 1 liter 1%-os vizes borkősav oldattal kirázzuk. Az acetont tartalmazó vizes fázishoz ciklohexánt adunk, míg ismét két fázis alakul ki. Összerázás és a fázisok szétválasztása után a felső, ciklohexán-aceton fázist hulladékként kezeljük, az alsó vizes fázist pH 8 értékre történő lúgosítás után benzollal extraháljuk, majd a benzolos extraktum bepárlása során izomorf ergotoxin-benzol-szolvát kristályt nyerünk. A fehér színű termék papír- és vákonyréteg kromatográfiával vizsgálva, csak az ergotoxinra jellemző 3 foltot tartalmazza. Kitermelés: 78% ergotoxin bázis: (á)l°: -187° (1% kloroformban). 2. példa: OKI 00088/72.SZ. Claviceps purpurea törzset szacharózt, ammóniumszukcinátot, ammóniunicitrátot, valamint anorganikus sókat tartalmazó táptalajon pH 5,4 értéken saválló fermentorban kevertetést és levegőztetést alkalmazva 7 napig inkubálunk. 1501 1600 y/ml ergokriptin-ergokornint tartalmazó 7 napos tenyészetet leszűrve a szűrlet és a micélium kloroformos extrakciója, annak besűrítése, majd petroléteres kicsapása útján 865 g nyers alkaloid bázist kapunk, mely 15,4% ergokriptint, valamint 15,2% ergokornint tartalmaz. A továbbiakban a találmány szerint eljárva a nyers alkaloid bázist 9 liter n-butilacetát és aceton 4:6 arányú elegyében feloldjuk, majd Brockmann II. aktivitású alumíniumoxid oszlopra öntjük. Az adszorbens töltet súlya 6 kg, magasság-átmérő 4,3:1. Az oldat adszorbensre történő beszívódása után az adszorbens elucióját a fenti oldószerpárral addig végezzük, mig az eluátum alkaloidot tartalmaz. Az összegyűjtött eluátumot 1%-os foszforsav oldat hozzáadásával 2 fázisra bontjuk. Ezután az 1. példa szerint a felső fázist elvetjük, és az alsó savas-vizes-acetonos fázishoz annyi xilolt adunk, míg ismét 2 stabil fázis alakul ki. Elválasztás után a felső, acetonosxilolt hulladékként kezeljük, az alsó savas-vizes alkaloid oldatból - már ismert módon - gyenge lúgoldattal az alkaloid bázisokat kicsapjuk. A csapadékot kiszűrés után vákuumban, max. 40 C°-on megszárítjuk, majd benzolban feloldva, és vákuumban besűrítve az ergokriptin-ergokornin párt kristályosítjuk. Hy módon 192 g ergokriptin-ergokornin izomorf benzol-szovát kristályt kapunk, mely aminosav analízis alapján meghatározva 51:49 arányban tartalmazza a fenti komponenseket. Kitermelés: 80,0% ergokriptin-ergokormin bázis: (a)k°: -185° (1% kloroformban). 3. példa: Claviceps purpurea OKI 00056/70 törzset glukózt, ammóniumszukcinátot és anorganikus 5 sókat tartalmazó táptalajon, pH 5,2 értéken az előzőkhöz hasonló módon fermentálunk. 200 liter 9 napos, 340 7/ml ergotamint, valamint 20 7/ml vízoldékony alkaloidot (ergometrin, kannoklavin) tartalmazó tenyészet micéliumának és szűrletének 10 metilizobutilketonos extraktumát egyesítve vákuumban szárazra pároljuk. A szárazmaradékot a találmány szerint eljárva 6 liter etilacetát és 4 liter izopropanol elegyében oldjuk. Az oldatot 10 kg Brockamann II. aktivitású alumíniumoxid oszlopra 15 visszük, majd ugyanezen oldószerpárral az aluciót addig végezzük, mig a van Urk színreakcióval vizsgálva az oldat alkaloidot már nem tartalmaz. Az alkaloidot tartalmazó eluátumhoz annyi 1%-os vizes kénsavoldatot adunk, mig a rendszer két 20 fázisra válik. Ha alválasztás után a felső fázis még alkaloidot tartalmaz, 2 liter kénsavoldattal kirázzuk, és az alsó fázisokat egyesítjük. Az alkaloidot tartalmazó kénsavas, vizes izopropanolos fázist 1/3 térfogat petroléterrel rázzuk ki. A felső fázist 25 elvetjük, az alsó fázisból az ergotamin bázist gyenge lúgosítással kicsapjuk, a csapadékot szűrjük, vákuumban legfeljebb 40 C°-on megszárítjuk. 59 g amorf ergotamin bázist kapunk. A bázis fajlagos forgatóképessége 30 (a)20 °: -159° (1% kloroformban). Kitermelés: 87% ergotamin bázis, melyből ismert módszerekkel ergotamintartarát nyerhető. 35 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás Claviceps purpurea szaprofita tenyészetek oldószeres extraktumaiból bepárlással, vagy 40 szénhidrogénekkel történő kicsapással nyert nyers peptid-alkaloidbázisok tisztítására, azzal jellemezve, hogy a pepiid-alkaloidokat tartalmazó nyersterméket vízzel elegyedő és vízzel korlátoltan elegyedő komponensből álló szerves oldószerpárban oldjuk, 45 az oldatot adszorpciós kromatografálással tisztítjuk, az eluciót azonos oldószerpárral végezve, a peptid-alkaloidot tartalmazó eluátumot híg vizes savoldat hozzáadásával két fázisra bontjuk, majd a peptid-alkaloidok sóit oldva tartalmazó nagyobb 50 fajsúlyú fázisból szénhidrogén vagy szénhidrogének hozzáadásával a savanyú vizet kiszorítjuk, a szennyezés mentes peptid-alkaloidot sóit tartalmazó vizes fázisból a kapott peptid-alkaloid sókat, adott esetben a vizes fázis meglúgosításával kapott 55 peptid-alkaloid bázisokat ismert módon kinyerjük, kívánt esetben a kapott peptid-alkaloid bázisokat más sóvá alakítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy vízzel elegyedő 60 szerves oldószerként valamely kis szénatomszámú alkoholt, előnyösen etanolt, vagy izopropanolt, vagy valamely kis szénatomszámú ketont, előnyösen acetont alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 65 módja, azzal jellemezve, hogy vízzel korlátoltan 4
