164094. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az EM-49 antibiotikum és összetevői előállítására
5 164094 6 frakcióknak eluálásuk sorrendjében EM—49—a, EM-49-ft EM-49-7 és EM-49-S a jelzése. Az egyes frakciók aminosavösszetételük és a zsírsavcsoportok szerkezeti különbségei alapján különböztethetők meg. Az aminosavelemzések azt mutatják, hogy az EM-49-a és -ß alak nem tartalmaz fenilalanint, és öt 2,4-diaminovajsavcsoport és három leucincsoport van bennük. Az EM—49-y é"s -5 alak egy fenilalanincsoportot, két leucincsóportot és öt 2,4-diaminovajsavcsoportot tartalmaz. Az EM-49-a és -ß a savas hidrolíziskor leszakadt zsírsavak szerkezetében, az EM-49—7 és -Ő ugyanebben különböznek egymástól. Az acetonban oldhatatlan port bizonyos rendszerekkel megoszlásosan kromatografálva, az EM-49-en kívül még egy lassan mozgó frakciót (SMF) kapunk, ez ugyancsak széles spektrumú hatékony antibiotikum. Ezt a frakciót úgy különíthetjük el és úgy tisztíthatjuk, hogy n-butanollal extraháljuk, majd dietilaminoetilcellulózon kromatografáljuk, és kovasav-cellulóz oszlopon ismételten megoszlásos kromatografálást végzünk, az eluálásra n-butanol, izovajsav, piridin és víz 40:9:4:10 arányú keverékét használva. Vagy másképpen az EM—49 SMF antibiotikumot úgy lehet elkülöníteni és tisztítani, hogy az acetonban oldhatatlan port Sephadex LH 20-on (alkilezett, térhálósodott dextrán) metanollal eluálva kromatografáljuk. Az SMF a bíborszínű kristályos reineckát keletkezése révén könnyen elkülöníthető. A következő példák a találmányt közelebbről szemléltetik. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg. 1. példa: Élesztő-húskivonat-agar ferde lemezeket Bacillus circulans ATCC 21656 mikroorganizmussal beoltunk, 1 éjjelen át 37°-on inkubáljuk, majd 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml szójalisztes vizes táptalaj beoltására használjuk. A tenyésztő közeg összetétele a következő: desztillált vízzel kiegészítve 1 literre beállítjuk a pH-t 7,0-ra CaC03 2,5 g 5 A fermentáló lombikokat a tenyésztő lombikokhoz hasonló módon inkubáljuk és rázatjuk. Három és hat nap elteltével mintákat veszünk, és papírkromatografálással és biológiai próbákkal vizsgáljuk. A megsavanyított táptalaj butanolos kivona-10 tának a papírkromatografálásra alkalmas mennyiségét Whatman 1. szűrőpapírra cseppentjük, és a kromatogramot n-butanol, ecetsav és víz 4:1:5 térfogatarányú oldószerrendszerrel kifejlesztjük. Ennek az oldószerrendszernek felső fázisát oldószer-1S ként használjuk. Az EM-49-hidroklorid Rf-értéke ebben a rendszerben 0,71. Az antibiotikumot Staphylococcus aureus FDA 209P és Escherichia coli ATCC 10536 mikroorganizmusokkal szembeni bioautografálással mutatjuk ki. A biológiai 20 próbákra mindkét mikroorganizmust hagyományos kémcsőhígításos próbákban használjuk. 25 30 2. példa: A Bacillus circulans ATCC 21656 mikroorganizmus 250 liter tenyészetét 378 literes rozsdamentes acél edényben a következő összetételű folyékony táptalajban és kísérleti körülmények között fermentáljuk: 1. szakasz Oltóanyag: A Bacillus circulans ATCC 21656 35 tenyészetet cseppfolyós nitrogénben tartjuk el, és szükség esetén a következő összetételű élesztő-húskdvonat-agar ferde lemezen tenyésztjük ki: 40 szójababliszt szárított burgonyaőrlemény glukóz CoCl2 «J2H 2 0 CaC03 desztillált vízzel kiegészítve 15,0 15,0 g 50,0 g 0,005 g 10,0 g 1 literre g 4S húskivonat élesztőkivonat pepton dextróz agar desztillált vízzel kiegészítve 1,5 g 3,0 g 6,0 g 1,0 g 15,0 g 1 literre 50 A táptalajt használat előtt 1,05 att nyomáson, 121°-on 15 percig sterilizáljuk. Az első tenyésztő edények beoltására a ferde lemezről vett telepeket használjuk. Ezt a táptalajt használat előtt 30 percig 121°-on 1,05 att gőznyomással sterilizáljuk. A beoltott tenyésztő lombikokat percenként 280 fordulatú és 51 mm löketű forgó rázógépben 25°-on 72 óra 55 hosszat inkubáljuk. 500 ml-es Erlenmeyer lombikba 100 ml vizes kukoricalekvárt töltünk, és a tenyésztő lombikból 2,5tf%-kal beoltjuk. Ennek a közegnek az összetétele a következő: 60 Táptalajösszetétel szójababliszt 15,0 g szárított burgonyaőrlemény 15,0 g glukóz 50,0 g CoCl2 • 2H 2 0 0,005 g CaC03 10,0 g desztillált vízzel kiegészítve 1000 ml-re 121°-on 30 percig sterilizáljuk. kukoricalekvár (NH4)H2 P0 4 élesztőkivonat dextróz 6,0 g 100 ml ilyen táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer 3,0 g lombikban forgó rázógépen 25°-on 72 óra hosszat 2,5 g inkubálunk. A rázógép percenként 280 fordulattal 10,0 g 65 és 51 mm lökettel működik. 3
