163901. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-formilrifamicin SV-származékok előállítására
163901 10 egérembrió sejtkészítményen és megvizsgáljuk gócképző egységekre BALB/3T3 sejtekben. A vizsgálatok végzésekor Hartley és Rowe (Proc. Nat. Acad. Sei., 55, 780. oldal. 1966) módszerének változatát alkalmazzuk. Munkánk során az edényekbe 1-2 X 106 sejtet adagolunk 25 ml táptalajba és 37 C° hőmérsékleten 24 óra hosszat inkubáljuk. A folyadék eltávolítása után előre meghatározott számú gócképző egység mellett vírust viszünk 0,5 ml táptalajba és az egyrétegű sejteken 90 percig, 37 C° hőmérsékleten adszorbeálni hagyjuk. Az adszorpciós periódus végeztével valamely rifamicin-származék (melyet előzőleg dimetilszulfoxidban 1 mg/ml koncentrációban oldunk) előre meghatározott, 5-10 Mg/ml dózis közötti mennyiségét 25 ml táptalajra visszük, és a tenyészeteket az inkubátorba visszahelyezzük. Egy külön tenyészet táptalajára kontrolként csak dimetilszulfoxidot adunk. A beoltás után 3 nappal a tenyészeteken folyadékcserét hajtunk végre, és a transzformált sejtgócokat naponta hétszer megszámláljuk. Ezzel a módszerrel tanulmányozzuk a Vesicularis Stomatitis (hólyagos szájgyulladás) vírusát, a New Jersey savótípust. A vírus szaporításának és vizsgálatának módszerét Hackett és munkatársai írják le (Virology, 31, 114. oldal, 1967.). E tulajdonságok azt igazolják, hogy e vegyületek hatékony gátló aktivitást fejtenek ki állatokon a vírus okozta daganatokkal szemben. A találmány szerinti vegyületek előállításmódja abból áll, hogy 3-formilrifamicin SV-vegyületet vagy 25-dezacetil-származékát vagy a megfelelő hexahidro-vegyületeket szerves oldószerben sztöchiometrikus mennyiségű H2 N-NRiR 2 általános képletű vegyülettel, mely képletben R, és R2 jelentése megegyezik az előbbiekben megadottakkal, kezeljük. Szobahőmérsékleten 10 perctől néhány óra hosszat tartó állás után a nyers vegyületet betöményítéssel vagy az oldószer elpárologtatásával kapjuk meg. E származékok tisztítása nem jelent különösebb problémát a szerves kémia területén jártas szakemberek számára: a tisztítást általában a célnak megfelelő oldószerekből, például kis szénatomszámú alkanolokból, kis szénatomszámú alkanolok kis szénatomszámú acilésztereiből vagy benzolból való átkristályosítással végezzük. A találmány szerinti vegyületek szerkezetéből következik, hogy a találmány oltalmi körébe tartozó nagyszámú vegyület szintetizálható oly módon, hogy megfelelő hidrazin-részeket választunk. Ha például a hidrazin-vegyület erős savas csoportot, például szulfo-csoportot tartalmaz, a végső rifamicin-származékot a 27. helyzetben a hidrazon-képződés alatt a megfelelő 27-dimetoxi-27-hidroxi-vegyületté hidrolizáljuk. A találmány tárgyát képező vegyületek előállítását a következő példa szemlélteti anélkül, hogy a találmányt arra korlátozná. Általános módszer hidrazonok előállítására 10 Tetrahidrofuránban oldott 0,01 mól 3-formilrifamicin SV-hez vagy 25-dezacetil- és megfelelő hexahidro-származékához szobahőmérsékleten, állandó keverés közben 0,01 mól hidrazint adagolunk. 15 10 perctől 3 óra hosszat tartó keverés után az oldat egy cseppjét vékonyrétegkromatográfiával szilikagélen megvizsgáljuk annak megállapítására, hogy a kiindulási vegyület eltűnt, és hogy a végtermék képződött. 20 Á karbonil-vegyület teljes eltűnése után az oldatot szárazra betöményítjük, majd a nyers terméket visszanyerjük és valamely oldószerből 25 átkristályosítással vagy oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Az I. táblázatban néhány reprezentatív vegyület 30 fizikai-kémiai adatait tüntetjük fel. Az I. táblázatban csak azokat a vegyületeket tüntetjük fel, melyek képletében R3 jelentése acetil-csoport, és amelyek nem hidrogénezett származékok. 35 Az I. általános képletű rifamicin-vegyületek hexahidro-származékainak, vagyis a 16-, 17-, 18-, 19-, 28-, 29-hexahidro-3-formilrifamicin SV-nek előállításához szolgáló kiindulási vegyületeket a 40 következő módon kapjuk: 600 ml száraz etanolban szuszpendált 20 g rifamicin S-t Parr bombában 2 g platinaoxid 45 katalizátorral 3 óra hosszat, szobahőmérsékleten, 5 atmoszféra körüli hidrogénnyomáson hidrogénezünk. A katalizátor leszűrése után az oldatot szárazra pároljuk és a nyers terméket tetrahidrofuránban oldjuk, majd szobahőmérsékleten, keverés 50 közben 18 g mangándioxidot adunk hozzá. A szervetlen csapadékot szűrjük, a szűrletet kis térfogatra betöményítve etilacetátban (300 ml) felvesszük és vízzel mossuk. A szerves fázist nátriumszulfáton szárítjuk: bepárlás után 8 g 55 hexahidrorifamicin S-t kapunk: olvadáspont 158-160 C° (metanolból). Ezután a terméket a megfelelő 3-formil-származékká átalakítjuk, lényegében az 1 219 360 számú Nagy-Britannia-i szabadalom 5. példájában leírt eljárásnak megfelelően. A 60 nyers termék kloroformos oldatát szilikagélen oszlopkromatográfiával tisztítjuk, és 1% metanolt tartalmazó kloroformmal eluáljuk. A kromatografált oldat bepárlásával kapott vegyület a 16-, 17-, 18-, 19-, 28-, 29-hexahidro-3-formilrifamicin SV: 65 olvadáspont: 126-133 C°. 5
