163700. lajstromszámú szabadalom • Eljárás puromicin előállítására
163700 3 lálása útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a tenyésztést 0,001—0,03%, előnyösen 0,01— 0,03%, Co(N03 ) 2 .6H 2 0 jelenlétében végezzük. (A törzset az Országos Közegészségügyi Intézetnél 1972. jan. 11-én 0087 szám alatt letétbe helyeztük.) Komplex fehérjeként peptont, kukoricalekvárt, szénforrásként kukoricakeményítőt, valamint adalékként szervetlen spkat, így CaC03 -ot és NaCl-ot előnyös használni. A törzs fenntartását burgonyafőzet-glükóz agáron végezzük. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,0 és 7,2 közé állítjuk. A táptalaj sterilezését 120—122 C°-on 30 percen keresztül előnyös végezni. A steril táptalajt a Streptomyces alboniger spóraszuszpenziójával oltjuk be. Az optimális fermentációs hőmérséklet növesztésnél (a tenyésztés 24. órájáig) 28 C°, termelésnél (24. órától a 40. óráig) 26 C°. Habzásgátlóként polipropilénglikolt használhatunk. A fermentáció befejezése után a savas szűrletből a puromicint Porter és munkatársai módszerével (2 763 642 számú USA-beli szabadalmi leírás) izoláljuk. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők : 1. A fermentációs idő csökkentését teszi lehetővé. 2. A keletkező puromicin mennyisége többszöröse a Co2 + -iont nem tartalmazó táptalajon elért szintnek. 3. Nem keletkezik gyakorlatilag számottevő menynyiségben a puromicinhez szerkezetileg közel álló (Rf=0,53) komponens, és így a feldolgozás során tiszta puromicint nyerünk. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példát adjuk meg: Példa: A Streptomyces alboniger burgonyafőzet-glükóz agárról nyert spóraszuszpenziójával beoltunk egy 100 1 hasznos térfogatú fermentort, melyben a következő összetételű táptalaj van: kukoricakeményítő 2 % kukoricalekvár (szárazanyagtartalom 50%) 0,5% pepton 2 % NaCl 0,3% CaC03 0,5% Co(N03 ) 2 .6H 2 0 0,02% A fenti komponensek keverékét csapvízzel felfőzzük, a pH-t NaOH-val 7,0 és 7,2 közé állítjuk, 30 percen át 121 C°-on sterilizáljuk és spóraszuszpenzióval beoltjuk. 26—28 C°-on fermentáljuk 38—42 órán át, 50 liter/perc levegőztetés, 0,8 att nyomás és 300 fordulat/perc kevertetés mellett. Habzásgátlóként szükség szerint polipropilénglikolt adagolunk a tenyészethez. A pH a fermentáció végére 8,0—8,2-re emelkedik, a puromicin-szint leálláskor 630 ug/ml. A puromicin meghatározást agardiffúziós módszerrel, Bacillus subtilis-szel fertőzött, pH 8-as agáron végezzük. Összehasonlítási alapként 100 ug/ml töménységű puromicin.2 HCl (Nutritional Biochem. Corp.) oldatot használunk. 4 A tenyészet pH-ját telített vizes oxálsav-oldattal pH 3-ra állítjuk, majd megszűrjük. Szűrési segédanyagként 2—5% Hyflo-Supercel-t (Johns-Manville) alkalmazunk. A szűrlet pH-ját 9,0-ra állítjuk be te-5 lített NaOH-oldattal, majd 1/5 térfogatú kloroformmal extrahálunk. A kloroformos extraktumot Na2 S0 4 -on végzett szárítás után 40—50 C°-on bepároljuk kb. 1/100-ad térfogatra, majd 24 órán keresztül 0 C°-on állni hagyjuk. A kristályosan kivált 10 puromicin bázist szűrjük és vákuumban 20 CD -on szárítjuk. Az így kapott kb. 70%-os hatóanyagtartalmú termékből 100% hatóanyagtartalmú puromicin-klórhidrátot állítunk elő 1 n HCl-ből végzett átkristályosítással. Az így kapott puromicin-klór-15 hidrát mennyisége az eredeti fermentleben levő hatóanyag 47,5 %-a. Az optimális Co2+ -ion igény kimérésére 5 literes laboratóriumi üvegfermentorban különböző menynyiségű Co 2 + -sót adagolunk a fenti összetételű, de 20 Co2+ -só nélküli táptalajhoz. Az így kapott biológiai aktivitásokat és a különböző komponensek %-os megoszlását 40 órás tenyésztési idő után az 1. táblázatban mutatjuk be (a rétegkromatográfiás vizsgálatnál az Rf=0,6-os komponens a puromicin, az 25 Rf=0,53 és Rf=0,75-ös komponensek szennyező melléktermékek). 1. táblázat Puromicin-termelés különböző mennyiségű Co2+ -ion jelenlétében Co(NOs ) 2 . Biol. érték Komponensek %-os megoszlása konc. (%) (Ug/ml) Rf=0,6 Rf=0,53 Rf=0, 0 200 50 50 — 0,001 260 60 38 2 0,002 340 80 18 2 0,005 450 98 0 2 0,01 650 98 0 2 0,02 540 98 0 2 0,05 360 90 0 10 0,1 150 70 0 30 0,3 70 50 0 50 A táblázat adataiból látható, hogy 40 órás te-50 nyészidőt használva, üvegfermentorban legelőnyösebben 0,01% Co(N03 ) 2 .6H 2 0-ot tartalmazó táptalajon dolgozhatunk. Hosszabb tenyészidőt alkalmazva az optimális Co2+ -ion koncentráció nagyobb. 55 Kísérleti üzemi 100 l-es fém-készülékben végezve a fermentációt, 40 óra fermentációs időnél 0,02% Co(N03 ) 2 .6 H 2 0 koncentrációt találtunk a legelőnyösebbnek. Szabadalmi igénypont Eljárás kísérő komponensektől gyakorlatilag mentes puromicin előállítására a Streptomyces 65 alboniger törzs [MNG—87] 24—29 C°-on, komp-2
