163661. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-tripszin-inhibitor izolálására szarvasmarha szerveiből
163661 polipeptid hígított vizes oldatból történő' elkülönítése, töményítése és sómentesítése, hanem messzemenő' tisztítása és a kísérőanyagok eltávolítása vált lehetővé. Az eljárás egyformán lefolytatható akár kromatográfiás oszlopokban, akár szakaszosan edényekben is. Az 1 274 128 számú NSZK-beli szabadalmi leírásnak, valamint a 2 040 107 számú közrebocsátott NSZK szabadalmi bejelentés leírásának az ismeretében is váratlan és messzemenően meglepő volt, hogy a találmány szerinti eljárással lehetővé válik a kallikrein-tripszin-inhibitor szelektív feldúsítása, illetve elkülönítése egy olyan oldatból, amely számos különböző polipeptidet tartalmaz. Alkalmas adszorbens-gyanták a porózus sztiroldivinilbenzol kopolimerizátumok, amint azt az 1 745 717 számú NSZK-beli közrebocsátott szabadalmi bejelentés leírása megadja. A porozitás előállítására felhasznált inert anyagok ö oldási paramétere az 1 274 128 számú NSZK-beli szabadalmi leírásban megadott határok között van. A találmány szerinti gyanták porozitás-adatai tehát nem különböznek az 1 274 128 számú NSZK-beli szabadalmi leírásban ismertetett gyanták adataitól. A S oldódási paramétert a ÁE elgőzölési energia és a megfelelő folyadék V mól-térfogat hányadosának négyzetgyöke határozza meg: Ő=(AE/V) 1/2 A V mól-térfogatot a _ mólsúly sűrűség képlet határozza meg. A ÁE elgőzölési energia kiszámítható a kísérletekkel könnyen meghatározható AH párolgási entalpiából, amely a AE-tő\ a térfogatváltozáshoz szükséges munka R • T-vel különbözik, tehát AE=AH-RT; (R—gázkonstans) (T=abszolút hőmérséklet K°). A AH irodalomban megadott értéke egy bizonyos hőmérsékletre vonatkozik. A y kiszámításához szükség van a sűrűség ismeretére; a sűrűséget helyettesíteni kell az értékkel, mely megfelel a fenti hőmérsékletnek. A nyerskivonat minősége a találmány szerinti eljárás lefolytatása szempontjából lényeges. Amennyiben a szervet, például a tüdőt, vagy parotis-t az 1 084 433 NSZK-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint metanol-extrakcióval dolgozzuk fel és a metanolt az extraktumból teljesen eltávolítjuk, akkor az extraktum derítés után az eljáráshoz közvetlenül alkalmas. A fajlagos aktivitás 70—90 KIE/mg (KIE=kallikrein-inhibitor-egység) szárazanyag. Amennyiben a feltárás szerves vagy ásványi sav hozzáadásával megy végbe, tisztítás után az inhibitor adszorbeálása gyantán nem tökéletes. Ezen a nyerskivonat erre alkalmas előkezelésével javítunk, például úgy, hogy sót, például ammóniumszulfátot adunk az elegyhez, vagy úgy, hogy a feltárást közvetlenül a ammóniumszulfát jelenlétében folytatjuk le. A só növekvő koncentrációjával fokozódik az 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 adszorpció, azonban a koncentráció nem növelhető oly mértékben, hogy az már az inhibitor kezdődő kicsapódását okozza. Ammóniumszulfát esetében legelőnyösebb 1,0—2,5 pH értéknél, a telítettség 0,2—0,5 részének megfelelő koncentráció. A gyanta minősége nagymértékben befolyásolja az eredményt. Sztirolból és divinilbenzolból készült porózus polimerizátumokat használunk, melyek Lewapol kereskedelmi néven (Farbenfabriken Bayer Ag., Leverkusen) kerülnek forgalomba. Különösen alkalmasak a nagy belső felülettel rendelkező gyanták (lásd táblázat): Táblázat: Kallikrein-tripszin-inhibitor adszorpciója nyers oldatokból porózus polisztirol-gyantákon Gyantatípus Felület m2 /g Adszorbeált inhibitor-mennyiség *KIE/ml gyanta mg tiszta anyag/ml gyanta Ca 9221 330 30300 4,3 Ca 9255 150 21000 3,0 Do 18/65 115 23000 3,3 Do 8/60 70 3 800 0,54 * KIE=kallikrein-inhibitor-egység (meghatározása: E. Vogel, I. Trauschold, E.Werle: Natürliche Proteinasen-Inhibitoren, G. Trieme Verlag, Stuttgart, 1966, 6. old.); 1 KIE a tripszines módszerrel vizsgálva, 0,7 meg kallikrein hatását gátolja. Az inhibitort különösen előnyösen savas oldatokból, 1—3 pH értéknél adszorbeáltatjuk a gyantán. Semleges körülmények között az adszorpció kevésbé tökéletes; alkalikus közegből az adszorpció jó, azonban így az inhibitort nehezebb eluálni. Az inhibitor adszorpciója után a gyantát vizes oldatokkal mossuk. Tiszta vízen kívül előnyösen kerül alkalmazásra 0,01 mólos sósavoldat és ezt követően 0,02 mólos etiléndiamintetraecetsav-nátriumsó oldata. Az inhibitor elúciója a gyantáról vízzel elegyedő szerves oldószerekkel, például metanollal, etanollal, izopropanollal, acetonnal és hasonló oldószerekkel történik. Amennyiben az eljárást oszlopon folytatjuk le, az inhibitort különösen tisztán eluálhatjuk, ha a szerves oldószer koncentrációját lassan fokozzuk és az eluátumot frakcionáltan fogjuk fel. Magától értetődő, hogy — mint ez a szakaszos eljárásnál is történik — az eluálás a szerves oldószer koncentrációjának fokozatos emelésével is lehetséges. A koncentráció, amelynél a kallikrein-tripszin-inhibitort eluáljuk, az oldószetől is függ. Metanollal eluálva az inhibitor 40—60%-nál, izopropanolnál a legnagyobb rész már 20%-nál leoldódik. A deszorpciós tulajdonságok változnak, amennyiben az oldószerekhez más anyagokat adagolunk. így például ammónia alkalmazása gyorsítja az elúciót, ennél azonban színező alkotórészek szintén leoldódnak. Amennyiben a szerves oldószert más anyaggal, például trietilaminnal helyettesítjük, elúció ugyancsak lehetséges. Poliakrilamidban, vagy acetilcellulóz-szalagon végzett elektroforézissel bizonyítást nyert, hogy az 2
