163588. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 7béta- (D-5-amino-5-karboxi-valeramido) -3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-CEF-3-AM-4-karbonsav antibiotikum előállítására

163588 27 28 alábbi összetételű XI. tápközeget tartalmazó ferde ágár-táptalajra visszük: XI. tápközeg : 1 % melasz (Blackstrap) 1 % sörélesztő 2,5% Difco-ágár pH = 7,0 A beoltott ferde ágár-táptalajokat 7 napig inkubáltuk 28 C° hőmérsékleten. Ezek a kapott kultúrák hidegen tárolva legalább 13 hétig stabilak. B) Inokulum-termelés további két lépésben: Első inokulum: Az A) lépésben kapott kultúrát közvetlenül a ferde agárról átoltjuk 40 ml 1 %-os szárított élesztő-tartalmú, 7,0 pH-értékű tápközegre (a Yeast Product Corporation terméke), egy 250 mles Erlenmeyer-lombikban, amelyet bedugaszolva tartunk. A lombikot egy 5 cm löketű, percenként 220 fordulattal működtetett rázókészüléken 2—3 napig rázatjuk 28 C° hőmérsékleten. Második inokulum: A fent leírt módon kapott első inokulum 2,5%-nak megfelelő mennyiségét egy 2% élesztő-autolizátumot (Fleischmann S—150) tartalmazó tápközegre oltjuk (pH = 7,0) egy Erlenmeyer-lombikban. Ebben a lépésben a kultúra jellemzően világos színű; az inkubációt az első inokulum előállításához hasonló körülmények között, 48 órát meg nem haladó ideig folytatjuk. C) lépés: Termelő tápközeg. Termelő tápközegként egy desztillált vízben literenként 30 g cefre-sűrítményt, 7,5 g szárított élesztőt és 0,25 tf./tf. % habzásgátlószert (Mobilpar—S) tartalmazó folyadékot alkalmazunk. Ezt a közeget kismennyiségű tömény nátriumhidroxidoldat hozzáadásával 7,0 pH-értékre állítjuk, Erlenmeyer-lombikokba töltjük és 121 C° hőmérsékleten autoklávban 15—20 percig sterilizáljuk. Lehűlés után a tápközeget 2,5% inokulummal oltjuk be, a B) lépésben kapott kultúra felhasználásával. Az inkubációt kb. 50—100 óra hosszat folytathatjuk, előnyös azonban 72 óra körüli inkubációs időszakot alkalmazni. Lombikonként kb. 30—50 ml térfogatú közeggel dolgozunk. Az inokulum mennyisége 1 %tói 5%-ig terjedhet, gyakorlatban azonban általában 2,5% ionkulum alkalmazása előnyös. D) lépés: Biológiai értékmérés. A fermentáció befejeztével a baktérium-sejteket centrifugálás útján eltávolítjuk és az így elkülönített fermentlevet 7,0 pH-értékű foszfát-pufferoldattal hígítjuk. Az így kapott oldatban jelenlevő lß-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi—cef-3-em-4-karbonsav koncentrációját a szokásos korong-módszerrel vizsgáljuk. Vizsgálati mikroorganizmusként Vibrio percolans (ATCC 8461) törzset alkalmazunk. A hígított fermentációs lébe mártott szűrőpapír-korongokat a Petri-csészékben elhelyezett és az említett Vibrio percolans törzzsel beoltott ágár-lemezek felületére helyezzük. Ugyancsak a beoltott ágár-lemezekre helyezünk oly szűrőpapír-korongokat is, amelyeket előzőleg ismert koncentrációjú 842A antibiotikum standard-oldatokba mártottunk. Az így kezelt lemezeket 28 C° hőmérsékleten éjjelen át inkubáljuk, majd mérjük a kapott gátlási zónák átmérőjét. A vizsgált oldatokban jelenlevő 842A antibiotikum 5 koncentrációját az ismert koncentrációjú 842A antibiotikum-oldatokkal felvett standard-görbe alapján, interpoláció útján számítjuk ki. Ezzel a módszerrel azt találjuk, hogy a Streptomyces lactamdurans MB—2908 törzs a fent leírt fermentációs 10 eljárás során 78,6 mcg/ml 842A antibiotikumot termelt. A jelen leírásban ismertetett biológiai kísérletekben alkalmazott különféle vizsgálat mikroorganizmus-törzsek az American Type Culture Collec-15 tion gyűjteményében letétbe helyezett és a nyilvánosság számára az alább felsorolt ATCC nyilvántartási számok alatt hozzáférhető törzsek: 20 25 Escherichia coli W—MB—60 ATCC 9637 Proteus vulgaris MB—838 ATCC 21100 Alcaligenes faecalis MB ATCC 212 Alcaligenes viscosus MB—12 ATCC 337 Vibrio percolans MB—1272 ATCC 8461 Bacillus subtilis MB- 964 ATCC 6633 A fenti leírás során különböző kereskedelmi termékeket említettünk táptalaj-alkotórész vagy egyéb felhasználásra kerülő segédanyag gyanánt. Ezek a leírásban kereskedelmi néven említett ter-30 mékek az alább megadott gyártócégek termékei; az alábbiakban megadjuk a szóbanforgó termékek rövid jellemzését is: Amber Yeast No. 300: autolizált sörélesztő egyik frakciója; gyártja; Amber Laboratories, 35 Juneau, Wisconsin. Mobil par—S: olaj-alapú habzásgátló-szer (összetételét a forgalombahozó cég nem ismerteti): gyártó: Mobil Oil Company, 150 E. 42nd Street, New York, N. Y. 40 Polyglycol 2000: polipropilénglikol-polimer alapú habzásgátlószer, átlagos molekulasúlya 2000; gyártó: Dow Chemical Company, Midland, Michigan. Biogel P—2: gél-szűrésre alkalmas szűrő-közeg; 45 metilén-bisz-akrilamiddal térhálósított poli-akrilamid; gyártó: Bio—Rad Laboratories, Richmond, California. Dowex 50: polisztirol-szulfonsav alapú kationcserélő gyanta; gyártó: Dow Chemical Com-50 pany, Midland, Michigan. Analtech G. F. Plates: kalciumszulfát-kötőanyagot tartalmazó szilikagél-lemez, fluoreszcenciaindikátorral ; vastagsága 250 mikron; gyártja: Analtech. Inc. Wilmington. 55 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás 7j8-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-60 -3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-cef-3-em-4-karbonsav (842A antibiotikum) és gyógyszerészeti szempontból elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy az új MA—2908 Streptomyces lactamdurans mikroorganizmus törzset (letétbe 65 helyezve a Northern Regional Research Laboratory 14