163492. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kreatinin-amidohidroláz előállítására

5 wmv. 6 2. példa Jól kinőtt Alcaligenes spec. WS 51400 tenyészetet tartalmazó ferde agaros csövet steril táptalajjal (összetételét lásd az 1. példában) lekaparunk és szuszpendálunk, majd hasonló összetételű 150—200 ml táptalajba visszük át steril körülmények között. 24 órás erős rázatás után a tenyészetet 1,5 liter ugyanilyen táptalajra átoltjuk, és további 24 órán át rázatjuk. Tenyésztésre megfelelő edényben 15 1, az 1. példában leírt táptalajt az Alcaligenes spec. WS 51400 jól kifejlődött előkultúrájának 1,5 literével erőteljes levegőztetés mellett tenyésztünk. Eközben az egész tenyésztési időtartam alatt a pH-t állandóan 7 értéken tartjuk. A kreatinin- és a glükóz-tartalmat állandóan követjük. A kreatinin-felhasználás főleg a második harmadban következik be, mialatt először a glükóz bomlik le. A kultúrát 30 °C-on tartjuk. 35 óra után 1,5 g baktérium-szárazanyagot nyerünk 11 tenyészoldatra vonatkoztatva. A kreatinin-amidohidrolázra vonatkozó specifikus aktivitás 1600 IU/g szárazanyagsúly. 3. példa A 2. példában leírt módon 60 1 térfogatban Alcaligenes spec. WS 51400-at tenyésztünk. Mihelyt a tenyészet a kívánt növekedési stádiumot eléri, friss táptalajt adagolunk a tenyészedénybe és ugyanolyan mértékben veszünk el az edényből tenyésztett oldatot. Eközben a hígítási arány (átfolyási sebesség munkatérfogat) 0,13— 0,18, előnyösen 0.16. Óránként 5001 levegőt vezetünk át az edényen. így folyamatos tenyésztéssel 3—5 g/l baktérium-szárazanyag kitermelést érünk el, melynek specifikus aktivitása megegyezik a 2. példában megadott értékkel. Az Alcaligenes spec. WS 51400 nagyon alkalmas a fentiekben ismertetett folyamatos tenyésztésre. Mindkét mikroorganizmus a Müncheni Műszaki Főiskola Bakteriológiai Intézetének gyűjteményében van letétbe helyezbe. 4. példa Nagy tisztaságú kreatinin-amidohidroláz izolálása. Kreatinin jelenlétében tenyésztett Alcaligenes spec. WS 51400 sejteket (1 kg szárazsúly) elválasztunk, 0,1 mólos káliumfoszfátpuflerrel (pH 8,0) 20 l-re töltjük fel, és hűtés nélkül nagynyomású diszpergálást alkalmazva körülbelül 800 atü nyomáson feltárjuk. Az extraktumhoz hozzávetőlegesen 1 liter 5 tf% 10%-os polietilénimin-oldatot (mólsúly körülbelül 1800) (pH 8) adunk. Káliumklorid (0,01 mól végkoncentráció) és ammóniumklorid (0,1 mól végkoncentráció) hozzáadása után 1 liter oldatra számítva 10 perc alatt 0,8 térfogat 90%-os vizes izopropanolt csepegtetünk be és az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten keverjük. A csapadékot lecentrifugáljuk, és a felülúszóhoz 0,45 térfogat 90%-os izopropanolt adunk. Az így kapott csapadékot, mely kreatinin-amidohidrolázból és kreatin-amidinohidrolázból áll, elválasztjuk, és 400 ml pH 8,0 értékű 0,02 mólos káliumfoszfátpuflerrel felvesszük. Az oldhatatlan maradékot elválasztjuk, és az oldatot ugyanilyen pufferrel egyensúlyba hozott 3,5 x 1 m méretű DEAE-Sephadex-oszlopra visszük fel. Felvitel után az oszlopot 1 térfogat 0,1 mólos káliumfoszfátpuflerrel (pH 8,0) mossuk, majd 0,2 mólos káliumfoszfátpuflerrel (pH 8,0) eluáljuk, mikoris a kreatinin-amidohidroláz-tartalmú frakciókat kapjuk. 5 Ezután az ioncserélő oszlopot 0,2 mólos, 0,3 mól nátriumkloridot tartalmazó káliumfoszfátpuflerrel (pH 8,0) eluálva a kreatin-amidinohidrolázt kapjuk. Az eluáció során kapott enzimaktivitásokat a következő táblázat mutatja: 10 Kreatinin-amidohidroláz és kreatin-amidinohidroláz elválasztása DEAE-Sephadex oszlopon: lépés protein mg kreatinin-amidohidroláz IÜ IU/mg kreatin-amidinohidroláz IU IU/mg izopropanolos kicsapás után 175 860 4,9 44 0,25 DEAE-Sephadex mosófolyadék 90 1 — 0 — 0,2 m pH 8,0 eluátum 29 787 27 0 — 0,2 m pH 8,0 + 0,3 m NaCL eluátum 13,7 1,8 0,13 41 3,0 Az előző példákban leírt kísérletek során a kreatininból kreatinin-amidohidroláz hatására képződött kreatint adenozintrifoszfát (ATP) hozzáadásával mértük, mely 35 kreatinfoszfokináz (CPK) jelenlétében kreatinfoszfáttá és adenozindifoszfáttá (ADP) alakul. A keletkezett ADP-t piruvát-kinázzal (PK) és tejsavdehidrogenázzal (LDH), valamint foszfoenolpiruvát (PEP) és NADH jelenlétében ATP-vé alakítottuk és a NADH-ot optikai-40 lag mértük. Ezek az ismert lépések a következőképpen mennek végbe: CPK (l)Kreatin +ATP *kreatinfoszfát +ADP; 45 PK (2) ADP +PEP •piruvát +ATP; LDH (3)piruvát +NADH +H+ •laktat +NAD+. 50 A kreatin-amidinohidroláz mérését a kreatinból keletkező karbamid mérésével végeztük; a karbamid ureázzal széndioxiddá és ammóniává hasítható, és a kapott ammóniát Berthelot-reakcióval mértük. 1 IU kreatinin-amidohidroláz illetve kreatin-amidino-55 hidroláz az az enzimmennyiség, amely 1 perc alatt 25 °C-on 1 (xmól szubsztrátot hasít. 60 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás oldható kreatinin-amidohidroláz és/vagy kreatin-amidinohidroláz tartalmú vizes fermentlé előállítására, azzal jellemezve, hogy Alcaligenes spec. WS 65 51400 vagy Pénicillium WS 90001 törzset asszimilálható 3