163467. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus aktivitású proteáz izolálására
163467 A proteolitikus aktivitást kazeinoldó egységekben (CE) kifejezve Kunitz módosított eljárásával [J. Gén. Physiol. 30, 291 (1947)] 8,0 pH-értéken határoztuk meg. Az enzim fibrinolitikus aktivitását fibrin-lemezeken Astrup T. és Müllertz S. [Arch. Biochem. Biophys. 40, 346 (1952)] módszere szerint határoztuk meg. A fibrinolitikus aktivitás mértékéül a 18 órás, 37 C°-on végzett inkubálás után nyert fibrinolitikus udvar átmérője szolgál. A találmány szerint Aspergillus ochraceusból izolált 0,0002 mg proteáz, illetőleg 0,001 mg kristályos tripszin a fibrin-lemezeken 16 mm-es átmérőjű udvart ad (0,05 M tris-HCl-puffer, 0,005 M CaCl2, pH: 7,4). Az Aspergillus ochraceus proteáz a tripszinhez viszonyítva ötszörös fibrinolitikus hatással rendelkezik. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik: 1. példa Aspergillus ochraceus tenyészetéből tanninos kicsapással izolált 50 g, 1,4 CE/mg proteolitikus összaktivitású nyers enzimkeveréket 4 x 200 ml 0,05 mólos trisz-HCl-pufferal (pH =7,2) 15 percen át mechanikai keveréssel extrahálunk. Az extrahált keveréket tisztára centrifugáljuk. (15000 g). A tiszta, sötétbarna színű, hatóanyagtartalmú oldatokat egyesítjük. Az össztérfogat 750 ml. A fenti teljes oldatmennyiséget 0—4 C°-on DEAESephadex A—50 anioncserélővei töltött oszlopon (10 x 18 cm) szűrjük, majd az oszlopot 7,2 pH-értékű 0,05 mólos trisz-HCl-pufferral mossuk. Az ioncserélőágy elkészítését úgy végezzük, hogy 50 g DEAE-Sephadex A—50 anioncserélőt 7,2 pH-értékű 0,05 mólos trisz-HCl-pufferral egyensúlyba hozunk. A fenti, még gyengén színes, hatóanyagtartalmú szűrletből (kb. 3500 ml) a hatóanyagot háromszoros térfogatú —20 C°-ra lehűtött etanollal kicsapjuk. A hatóanyag tökéletes leválása céljából a csapadékos folyadékot éjszakán át —20 C°-on tartjuk, majd a csapadékot centrifugálással elkülönítjük, etanollal és acetonnal mossuk és vákuumban szárítjuk. 4,43 g, 11,6 CE/mg aktivitású fibrinolitikus hatású, proteázban dúsított terméket kapunk. Ennek 1,5 g-ját 8 ml deszt. vízzel elegyítjük, átkeverjük és az oldhatatlan maradéktól centrifugálással (5000 g) elkülönítjük. A tiszta, barnás színű extraktumot 0—4 C°on vízzel duzzasztott Sephadex G—75 géllel töltött oszlopon (2,5x95 cm) szűrjük és desztillált vízzel eluáljuk. Az oszlopról levett eluátumot 20 ml-es frakciókban fogjuk fel. 220 ml inkatív előszűrlet után, a 12—18. frakciók hatóanyagot tartalmaznak, a színezékek és a kisebb molekulasúlyú fehérjék pedig az oszlopon maradnak. A hatóanyagot tartalmazó oldatot (140 ml) liofilizáljuk. 616 mg, 15,7 CE/mg fajlagos proteolitikus aktivitású, könnyen oldható, száraz, fehér port kapunk. Aspergillus ochraceus-ból tanninos kicsapással izolált 20 g, 1,0 CE/mg proteolitikus összaktivitású nyers 5 enzimkeveréket az 1. példa szerint extrahálunk. A tiszta, sötét színű, hatóanyagtartalmú oldatot (290 ml) DEAE-Cellulose anioncserélővei töltött oszlopon (4,5 x 15 cm) — melyet 7,2 pH-értékű, 0,05 mólos trisz-HCl-pufferral egyensúlyba hoztunk — szűrjük át. 10 Végül az oszlopot 0,05 mólos trisz-HCl-pufferral (pH =7,2) mossuk. A hatóanyagtartalmú szűrletből (kb. 400 ml) a hatóanyagot az 1. példában leírt módon kicsapjuk. Ekkor 3,19 g, 4,5 CE/mg aktivitású, fibrinolitikus hatású, 15 proteázban dúsított terméket kapunk, amelyet nagytisztaságú hatóanyag előállítása céljából az 1. példa szerint gélkromatográfiának vetünk alá. 2. példa 20 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás fibrinolitikus aktivitású proteáz izolálására penészgombatenyészetekből, az Aspergillus ochraceus tenyészetéből (IMET PA. Nr. 126) tanninos kicsapással elkülönített nyers enzimkeveréket vizes pufferoldattal 25 extrahálva, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagtartalmú extraktumot kevéssé térhálós dextrán dietilaminoetilszármazékon vagy dietilaminoetil-cellulózon mint anioncserélőn szűrjük át, a hatóanyagtartalmú szűrletből a hatóanyagot vízzel elegyedő szerves oldószerrel ki- 30 csapjuk, a csapadékot vákuumban szárítjuk, vízben oldjuk, majd 7—11 ml/g vízfelvevőképességű térhálós dextrángélen kromatografáljuk és a fibrinolitikus aktivitású proteáz tartalmú frakciókat liofilizáljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 35 módja, azzal jellemezve, hogy az Aspergillus ochraceusból elkülönített nyers enzimkeveréket 6,5—-7,5 pH-értékű, előnyösen 7,0—7,2 pH-értékű 0,05—0,1 mólos trisz-HCl-pufferral vagy 0,05—0,1 mólos ammóniumacetát-pufferral extraháljuk. 40 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagtartalmú extraktumot 0,5—0,9 mekv./g kapacitású kevéssé térhálós dextrán díetilaminoetil-származék vagy dietilaminoetil-cellulóz anioncserélővei töltött, az extraháló 45 pufferral egyensúlyba hozott oszlopon, előnyösen 0—4 °C-on szűrjük át, az anioncserélőt a pufferral mossuk és a hatóanyagot a szűrletből vízzel elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen —20 C°-ra lehűtött, 1: 3 arányban alkalmazott etanollal csapjuk ki. 50 4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az anioncserélővel végzett kezelés után kapott anyagot kevés vízben feloldjuk, 7—11 ml/g vízfelvevőképességű térhálós dextrángéllel töltött oszlopon, előnyösen 0—4 C°- 55 on kromatografáljuk, vízzel eluáljuk, az eluátumot frakciókban összegyűjtjük és a fibrinolitikus aktivitású proteáz tartalmú frakciókat liofilizáljuk. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 76.3495.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató ' ' \ i \
