163407. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-triptofán előállítására fermentációs úton
3 163407 4 nyék mellett 24—96 óra hosszat fermentáljuk asszimiálható szén- és nitrogénforrást, esszenciális ásványi sókat és prekurzorként indolt vagy antranilsavat tartalmazó fermentációs közegben kb. 5 és 8 pH érték és 20—40 °C hőmérsékleti határok között. A fermentáció befejezése után elérhető hozam 1500—11 000 y/ml vagy ennél több, a táptalaj összetételétől, valamint a fermentációs időtől és hőmérséklettől függően. Az S—10 mutánst az alábbiak szerint egy olyan, bakteriális fehérjébe nem beépülő triptofán-homológ, éspedig 5-metiltriptofán (5-MT) jelenlétében állítottuk elő, amely elnyomja a triptofán szintézisnél működő enzimek képződését. 10 ml M 40 jelű, 200 y/ml 5-MT-t tartalmazó szintetikus táptalajt 9 cm átmérőjű Petri-csészébe öntöttünk. Ezután második rétegként egy olyan elegyet alkalmaztunk, amely 2,5 ml előbbi táptalajból, 2 ml Bacillus subtilis szuszpenzióból és 0,5 ml 1000 y/ml koncentrációjú 5-MT oldatból állt, 28 °C-on történő inkubálás után 5 MT rezisztens telepek jelennek meg, és egyes telepek körül nem rezisztens baktériumokból álló kísérő körletek szaporodtak fel. A kísérő telepek voltak azok a mutánsok, amelyek a fermentációs táptalajban L-triptofánt képesek akkumulálni. Ezekből a rezisztens mutánsokból választottuk ki az S—10 mikroorganizmust, amelyet a jelen találmány során felhasználunk. A mutáns előállításánál felhasznált M—40 jelű szintetikus táptalaj összetétele a következő: KH2 P0 4 0,1 g MgS04 . 7 H 2 0 0,05 g (NH4)2 S0 4 0,35 g aszparagm 0,15 g glükóz lg (csapvízzel 100 ml-re feltöltve). 1. példa S—10 tenyészetet ferde agárról leöblítünk és ezt használjuk 100 ml alábbi összetételű táptalaj beoltásához: glükóz 8 g KH2 P0 4 0,1 g MgS04 . 7 H 2 0 0,05 g (NH4)2 S0 4 0,35 g (csapvízzel 100 ml-re feltöltve). Nátriumhidroxid hozzáadásával 7,0 pH-értéket állítunk be, a pH-érték sterilezés után 6,7-re csökken. A mikroorganizmust 24 óra hosszat 28 c C-on tenyésztjük, majd 4 liter, előbbivel azonos összetételű táptalajt tartalmazó üvegfermentort oltunk be vele. A fermentort 28 °C-on 800/perc fordulatszámmal kevertetjük és 1 tf/tf/perc mértékben levegőztetjük. A pH-értéket steril kalciumkarbonát periodikus hozzáadásával 6,0—6,5 értékek között tartjuk. 24 órás kortól kezdve 1 órás időközökben a fermentációs táptalajhoz 25 y/ml antranilsavat adunk. 72 órás fermentációs idő után 1675 y/ml L-triptofán gyűlik össze a fermentációs közegben, amelyet a szokásos aktívszenes adszorpcióval és eluálással izolálunk. 2. példa Az 1. példa szerinti eljárást megismételjük azonos táptalaj felhasználásával. A fermentációs táptalajt az S—10 5 törzzsel való beoltás után az 1. példával azonos körülmények mellett tartjuk. A fermentáció 25. órájától kezdve órás időközökben 25 y/ml antranilsavat és 30 y/ml ammóniumszulfátot adunk a táptalajhoz. A fermentáció végén 2686 y/ml L-triptofánt kapunk. 10 3. példa S—10 tenyészetet ferde agárról leöblítünk és 100 ml, az 1. példában megadottal azonos összetételű táptalaj 15 beoltásához használjuk. 24 órás 28 "C-on történő tenyésztés után 4 liter, előbbivel azonos táptalajt tartalmazó fermentort oltunk be. A tenyészetet 800/perc fordulatszámmal kevertetjük és 1 tf/tf/perc mértékben levegőztetjük. 24 óra eltelte után az előtenyészetet 5 tér-20 fogatszázalék mennyiségével az alábbi összetételű táptalajt oltjuk be: glükóz 7 g (NH)4)2 S0 4 0,7 g 25 KH2 P0 4 0,2 g MGS04 .7 H 2 0 0,5 g (csapvízzel 100 ml-re feltöltve). 30 A táptalaj pH-ja sterilizálás után 6,7. A fermentáció feltételeit az előzővel azonosan szabályozzuk azzal az eltéréssel, hogy a kalciumkarbonát hozzáadásával 5,8— 6 közötti pH-értéket állítunk be. 16 órás tenyésztés után prekurzorként az alábbi táblázatban megjelölt idő-35 közökben minden órában indolt adagolunk a táblázatban feltüntetett mennyiségben: Az indoladagolás mennyisége óra y/ml 16—19 100 20—24 150 25—31 125 32—42 100 43—45 150 48—62 100 68—69 100 80—86 60 Az L-triptofán táptalajban levő koncentrációját különböző időpontokban az alábbi táblázatban szemlél-55 tétjük: A triptofán mennyisége óra y/ml óra y/ml 16 57 60 7444 24 1826 72 9 296 36 4460 84 9 064 48 6452 96 10 380 2
