163148. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az aminocsoportok megvédésére piridil-metoxikarbonil-csoporttal, főképp a peptidszintézis során
163148 15 módon 1,0 g (N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-L-valint kapunk. Összetétel: számított: N: 10,44%; talált: N: 10,37%. 21. példa 2,17 g polimixin B-nek 145 ml dimetilformamiddal készült szuszpenziój álhoz hozzáadunk 3,18 g az 5. példa szerint készült vegyes (N-oxido-3--piridil-metil)-(p-nitrofenil)-karbonátot. 60c -on való 24 órai és 20°-on való 65 órai keverés után az oldhatatlan részt szűréssel eltávolítjuk. A szüredéket 0,3 torr nyomáson 60°-on szárazra pároljuk. A kapott olajat 7 ml metanolban oldjuk, és az oldatot 38 mm átmérőjű, 1,80 m magas Sephadex LH 20 oszlopon kromatografáljuk. Metanollal eluálunk 7 ml-es frakciókat gyűjtve. A 130—170. frakciókat egyesítjük, és 20 torr nyomáson 50°-on bepároljuk. így 3,2 g penta-N-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-polimixin B-t kapunk. Rf = 0,30 (kovasavgélen, 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz rendszerben). 22. példa 300 mg a 12. példa szerint készült penta-N-(3--piridil-metoxikarbonil)-kolisztinnek 3 ml dimetilformamid, 10 ml metanol és 2 ml n sósav elegyével készült oldatához hozzáadunk 300 mg 3,15% palládiumot tartalmazó palládiumszenet, és lassú hidrogénáramot bocsátunk át rajta 16 óra hosszat. Szűrés és a szüredéknek 0,3 torr nyomáson 50°-on való bepárlása után a szilárd maradékot feloldjuk 5 ml metanolban, és az oldatot 50 g Sephadex LH 20-at tartalmazó, 14 ml átmérőjű és 1,90 m magas oszlopon kromatografáljuk. Metanollal eluálunk, és 2 ml-es frakciókat gyűjtünk. A 40—46. frakciókat egyesítjük, 10 ml desztillált vízzel eluáljuk, és a kapott oldatot liofilizáljuk. Ily módon 158 mg kolisztin-penta-hidrokloridot kapunk. Rf = 0,29 (kovasavgélen; 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz rendszerben). 23. példa 1 g a 13. példa szerint készült penta-N-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-kolisztint —33°on feloldunk 200 ml frissen desztillált cseppfolyós ammóniában. Ehhez az oldathoz kis részletekben nátriumot adunk addig, míg a kék színeződés több mint 5 percig megmarad. Ezután a reakciókeveréket 700 mg ammóniumkloriddal elszíntelenítjük. A reakciókeveréket keverve az ammóniát 0°-on elpárologni hagyjuk. A szilárd maradékot feloldjuk 0°-on 50 ml desztillált vízben, a reakciókeveréket n sósav hozzáadásával beállítjuk 6 pH-ra, az oldhatatlan részt elvá-16 20 lasztjuk, és a szüredéket 0,3 torr nyomáson 50°on szárazra pároljuk. A szilárd maradékot 3 ml metanolban oldjuk, az oldhatatlan részt szűréssel elválasztjuk, és a szüredéket 40 g Sephadex 5 LH 20-at tartalmazó, 14 mm átmérőjű és 1,7 m magas oszlopon kromatografáljuk. 100 ml metanollal eluálunk, és az eluátumot 20 torr nyomáson szárazra pároljuk. Ily módon 508 mg kolisztin-penta-hidrokloridot kapunk. 10 Rt = 0,29 (kovasavgélen; 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz rendszerben). 24. példa 15 1,5 g a 13. példa szerint készült penta-N-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-kolisztinnek 230 ml 7,5 pH-ra pufferolt oldattal készült 37c -os oldatához hozzáadunk 50 mg szubtilizint, és a reakciókeveréket 37°-on 15 percig keverjük. Ezután azonnal lehűtjük —70°-ra. Liofilizálás után krémszínű port kapunk, ezt feloldjuk egy 800 ml n-butanol, 200 ml piridin, 100 ml ecetsav és 900 ml víz nehéz fázisából vett 10 ml oldatban. Az „5 oldatot ellenáramú megosztásnak vetjük alá 60 csöves készülékben, amelynek minden csöve 10 ml nehéz fázist és 10 ml könnyű fázist tartalmaz. A megosztás befejeztével minden cső tartalmát 25 torr nyomáson 60°-on szárazra pároljuk. A 30 25—31. csövek maradékát feloldjuk összesen 20 ml vízben, és az így kapott oldatot liofilizáljuk. 246 mg tri-Nj, -(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-kolisztinamint vagy ciklo-[Nj; -L-a,y-diaminobutiril-Nj, -(N-oxido-3-piridil-metoxikar-35 bonilJ-L-a^-diaminobutiril-D-leucil-L-leucil-N y -(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-L-a,7--diaminobutiril-Ny -(N-oxido-3-piridil-metoxi-karbonil)-L-a,7-diaminobutiril-L-treonil] -t kapunk. Rf = 0,27 (kovasavgélen, 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz rendszerben). Teljes hidrolízis után a Technicon automatikus elemzőkészülékkei a következő aminosavakat sikerül kimutatni: Dab = 4,07 (elméleti 4), Leu = 2,00 (elméleti 2), Thr = 0,98 (elméleti 1). Analóg módon eljárva, de a szubtilizint nagarzzal, pronázzal, kolisztinázzal, alkalázzal vagy 50 a B. subtilis Glaxo 417, B. subtilis ATCC 9524, vagy Bacillus THE 4 által termelt proteázokkal helyettesítve ugyancsak a fent leírt ciklikus polipeptidet kapjuk, kovasavgélen való kromatografálással azonosítva. 55 Rf = 0,27 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz rendszerben. A penta-N-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-kolisztin feloldására használt 7,5 pH-jú pufferoldat előállítására 34 ml ecetsav és 700 ml desz-60 tillált víz elegyét 5 n vizes ammóniaoldattal beállítjuk 7,5 pH-ra, pH-mérővel meghatározva, és az oldatot desztillált vízzel 1000 ml-re egészítjük ki. 40 45
